Primer Design

IGV图片等

SLC7A5

N-SLC7A5-sg和C-SLC7A5-sg自动破坏PAM，它只有一种transcripts。

ABL1

Transcript Variant: This variant (a) includes an alternate 5′ terminal exon (exon 1a instead of exon 1b), and it thus differs in the 5′ UTR and 5′ coding region, compared to variant b. The encoded isoform (a), which is localized in the nucleus, has a distinct N-terminus and is shorter than isoform b.

Transcript Variant: This variant (b), which includes exon 1b but not exon 1a, represents the longer transcript and encodes the longer isoform (b). This isoform contains an N-terminal glycine which could be myristylated, and it is thus thought to be directed to the plasma membrane.

从之前自己的K562测序数据看，感觉都是variant b，所以就按照variant b的start codon来做N-dTAG了。

但是从IGV明显看出后半截的Exon表达远多于Exon1，可能不止有variant b Exon1这里起始转录。感觉对于ABL1来说，还是C端dTAG覆盖更广。

N-ABL1-sg做了同义突变disrupt PAM。C-ABL1-sg这里其实从PAM上游12bp~20bp就阶段了，但是保险起见，对终止密码子做了UAG > UAA同义突变，这样在PAM上游9 bp也错配了。（这里UAG作为最弱stop codon换成最强的UAA应该没问题）。

PTPN1

Transcript Variant: This variant (2) lacks an alternate exon in the 5′ coding region and uses a downstream start codon compared to variant 1. It encodes isoform 2, which has a shorter N-terminus compared to isoform 1.

Transcript Variant: This variant (1) represents the longer transcript and encodes the longer isoform (1).

variant (1)肯定是在表达，但是variant (2)完全是(1)的子集，看不出来。

等等，我发现，variant (1)多的那个exon，左右两边都有junctions，但是没有跨过它的junctions，说明没有variant (2)表达，几乎全都是variant (1)，所以按照variant (1)来设计，即可。

N-PTPN1-sg和C-PTPN1-sg 这里都需要考虑额外disrupt PAM。

Disrupt PAM时，都按照这张表选了频率相近的同义密码子替换。

TYMS

TYMS有三个isoform，但它们的start codon和stop codon一样，所以可以只设计1个N-tag，1个C-tag。

N-TYMS-sg自动突变PAM，C-TYMS-sg人为替换同义密码子。

THG1L

IGV可以看出，那俩Exon1靠后的没有表达，中间的Exon短一截的那个也没有。所以就按照isoform(1)构建就行。

N-THG1L-sg自动突变PAM。C-THG1L-sg在stop codon之前几个密码子做了同义突变。

ATAD5

ATAD5的所有isoform起始和终止密码子位置相同。N-ATAD5-sg自动突变PAM，C-ATAD5-sg也自动突变PAM（注意sgRNA序列完整，但如果stop codon前面紧跟GFP或mCherry最后一个氨基酸，则PAM的两个G都被破坏）

RAD51

RAD51有多条variants，共3个不同的start codon，2个不同的stop codon。

（倒数第二个外显子有skipping，导致最后一个Exon读码框错一位，终止提前。）可以看到发生Exon skipping的Reads很少，但也是有的。不过，这部分isoform全dTAG了效果应该也不明显（除非这个isoform有重要功能），这里就仅对C端靠后的stop codon构建dTAG。

（倒数第二个外显子有skipping，导致最后一个Exon读码框错一位，终止提前。）可以看到发生Exon skipping的Reads很少，但也是有的。不过，这部分isoform全dTAG了效果应该也不明显（除非这个isoform有重要功能），这里就仅对C端靠后的stop codon构建dTAG。

start codon感觉最靠前的和最靠后的都不表达，中间的表达最多。

N-RAD51-sg选在了切割位点距离target(ATG之后)距离37bp的位置，应该是今天设计的所有dTAG里最远的，之后记得比较一下同源重组效率会不会偏低。N-RAD51-sg做了同义突变disrupt PAM。C-RAD51-sg自动突变disrupt。

ELOF1

ELOF1只有一种isoform，而且蛋白很小。N-ELOF1-sg自动突变PAM(5’端11bp，虽然不是种子序列，但是长度足够，应该没问题）。C-ELOF1-sg自动突变PAM。

Gene	Protein (kDa,不算标签)	N-term sgRNA	C-term sgRNA	N-term PAM disrupt	C-term PAM disrupt	Isoform情况
SLC7A5	55.0	gcgcagagcatggcgggtgc	gtcccccaggagacatagcc	自动破坏PAM(剩8bp+NGG)	自动破坏PAM(剩5bp+NGG)	只有一种transcript
ABL1	125.0	tactttatggggcagcagcc	gtgcagaggtagcagcagtc	同义突变破坏PAM (GGGCAG > GGCCAA disrupt PAM)	stop codon UAG→UAA，同义突变破坏PAM	variant b为主（根据K562数据）但是从IGV明显看出后半截的Exon表达远多于Exon1，可能不止有variant b Exon1这里起始转录。感觉对于ABL1来说，还是C端dTAG覆盖更广。
PTPN1	50.0	gcccgtcatggagatggaaa	gctatgtgttgctgttgaac	需额外同义突变破坏PAM(GAGATGGAAAAG > GAAATGGAGAAA)	需额外同义突变破坏PAM (TTCAAC > TTTAAT)	variant 1主要表达，variant 2基本无表达
TYMS	21.1~35.7	cgcccgccgcgccatgcctg	tccattttaatagttggatg	自动破坏PAM(剩4bp+NGG)	同义突变破坏PAM (CATCCAACTATT > CACCCTACAATC)	3个isoform，start/stop一致
THG1L	34.8	ctttccgcgtgtagaatgtg	ctgtcttcatctagaatctc	自动破坏PAM (剩2bp+NGG)	stop codon前几个密码子同义突变 (gagattctagatgaagac > GAAATCCTGGACGAGGAT)	isoform(1)表达，其余不表达
ATAD5	113.3~201.2	ggaagcggggagtatggtgg	attgttagtatggaacatta	自动破坏PAM (剩4bp+NGG)	自动破坏PAM（stop codon前若接GFP/mCherry则PAM GG破坏）	所有isoform起止一致
RAD51	36.8~37.0	agcaaatgcagatacttcag	aaacccaatgattcagtctt	同义突变破坏PAM（ATG后37bp处 gaagcaaatgcagatact > GAGGCTAACGCTGACACA）	自动破坏PAM (剩5bp+NGG)	多个variant，主要中间start codon isoform表达，C端stop codon靠后为主
ELOF1	9.5	tttctgcgccccatgtctgc	tcctctgtgtcgctactgat	自动破坏PAM（5’端11bp，不在seed但足够, 剩9bp+NGG）	自动破坏PAM (剩5bp+NGG)	单一isoform，蛋白很小
RTCB	55.2	attatagctgcgactcatgg	gtgatcaaaggatagaacct	自动破坏PAM (剩5bp+NGG)	自动破坏PAM (剩8bp+NGG)	单一isoform

经查，在染色质易位时，BCR的启动子包括N端部分，截获ABL1的Exon2前面的内含子，形成BCR-ABL1融合蛋白。细胞内同时存在图示的四种蛋白；
从K562的RNA seq可以看到，ABL1在标准参考基因组上，从Exon 2之后表达量远高于Exon 1b，应该就是BCR-ABL1表达的RNA映射到这里了；
N端加dTAG只会tag上WT ABL1（另一个ABL1-BCR也会tag上但是无功能，我们只要鉴定纯合子即可），不会tag上BCR-ABL1;
而C端加dTAG会同时tag上WT ABL1和（BCR-ABL1）。

总结：
想只降解WT ABL1，用N端dTAG；
想同时降解WT ABL1和BCR-ABL1融合蛋白，用C端dTAG;
目前两个都构建了

构建过程

2025.9.4

multiplex nested PCR using two primer suites in one reaction at the same time. 这里看到了nested PCR的神奇之处，C-RAD51, N-PTPN1这几个都P得不太好，但是下一张图中PCR就成功得到正确条带了，而且非常的亮。

PCR of Homologous Arm form the nested PCR product. 可以看到N-RAD51不太理想，下面有个比目的条带更亮的条带。另外就是N-TYMS的left arm和right arm都没成功，但是nested PCR是有N-TYMS的genomic条带的。我打算把上一步nested PCR的N-RAD51和N-TYMS先进行一步切胶回收，回收产物作模板再PCR一次，这样应该就把小条带给筛掉了。其他的成功样品可以稀释后直接做三片段overlap PCR了（left Arm + N/C dTAG (mCherry) + right Arm）。

left+dTAG+right三合一PCR啥都没P出来，全在泳道入口卡着下不来，后来发现严重设计失误，两侧universal sgRNA target位点一致，导致不断搭桥延伸。

对于N-RAD51和N-TYMS的重新PCR，N-RAD51的结果和之前一样，虽然模板切胶了，但是小杂带依然出现。对于N-TYMS，这次left-Arm P出来了，虽然有杂带，但说明模板是没有问题的，那么right-Arm为什么P不出来呢？查了一下图谱发现，right arm的引物对的TM高达80%和87%，于是加了5%的DMSO重新试了一下。结果也没P出来，暂且放弃TYMS的N端dTAG构建了。

另外，对于PX458-mCherry的18个sgRNA质粒构建，竟然板子上一个转化子都没长。我怀疑是用的vector的问题，golden gate对于模板只需要很少，一个反应是50 ng/μL的载体加0.05 μL。因为不好吸，我冻存的都是5 ng/μL的载体，每次加1 μL。之前好像也有一次用这个5 ng/μL的载体重新转化扩繁质粒没有长东西。我怀疑是不是保存浓度太稀的质粒更容易降解啊。又老老实实重新用高浓度载体稀释，重新做了一次GGA，希望这次能长。

2025.9.8

PX458-mCherry的18个sgRNA这次长了，但是数量都很少，除了N-PTPN1和N-SLC7A5一个菌落都每长，其他的都送测了一个菌落。(不过昨晚偷懒了没来lab，都是卫星菌落了，应该没影响吧）

为了解决target位点导致的不断相互搭桥生成超长产物的问题，我打算将原计划的“3合1 overlap PCR产物，单片段与载体连接”的方案，变成“双片段与载体连接”。对于N端dTAG，将标签与right同源臂融合PCR，对于C端dTAG，将标签与left同源臂融合PCR，同时，N端的left同源臂和C端的right同源臂，再进行一步PCR，加上用于in-fusion cloning的overlap区域。这张图的PCR结果显示，N-left和C-right大部分都正常得到产物（除了N-RAD51杂带影响很大），而融合标签的都拖尾严重.

我检查了引物设计，觉得方案没问题，于是怀疑是不是N-dTAG和C-dTAG的标签模板太脏了，于是胶回收纯化后，又重复PCR了一次。

可以看到N-tag和C-tag模板有一点点杂带，但影响应该不大，不至于P不出来猜对。

重新PCR的结果跟之前几乎一样（C-ATAD5一直到RTCB是因为加样问题），还是拖尾。我几乎崩溃了。但是突然一想，会不会是上样量太大了，所以跑胶条带拖尾了，于是挑了8个样品，上了非常少的量，结果非常amazing啊，干干净净的条带，就是正确大小。我要吐了，前一天的正确的样品我已经扔掉了。只能重新做了。

按照目前的胶回收产物来看：

	ABL1	ATAD5	ELOF1	PTPN1	RAD51	RTCB	SLC7A5	THG1L	TYMS
N-left	√	√	√	√	√（有杂带干扰，所以产量低，但是可以试一下）	√	√	√	√（有杂带）
N-tag+right	√	√	√	√	√	√	√	√	放弃
C-left+tag	√						√	√
C-right	√	√	√	√	√	√	√	√	√

这样看的话，N-ABL1, N-ATAD5, N-ELOF1, N-PTPN1, N-RAD51, N-RTCB, N-SLC7A5, N-THG1L, C-ABL1, C-SLC7A5, C-THG1L都可以开始直接连接了。C-ATAD5, C-ELOF1, C-PTPN1, C-RAD51, C-RTCB, C-TYMS的C-left+tag片段还需要重新PCR。

用了DNA Assembly Mix PLUS (D0204P)进行连接（0.5μL商业化载体，两个片段各1 μL，50 ℃反应15 min）

查看测序结果：

C-ABL1, bac4错误，其他还需等待结果；

C-SLC7A5, bac1,2,3错误，其他还需等待结果；

C-THG1L, bac1,3,4错误，bac2未测通；

N-ABL1, bac3错误，bac1错误(mCherry没连上,是EGFP的序列？？？？)

N-ATAD5, bac2错误, bac1错误(mCherry没连上)

N-ELOF1，还需等待结果（这个有mCherry序列，还好还好）

N-PTPN1，还需等待结果；；

N-RAD51, bac1,3,4错误（坏了，还是mCherry全错）

N-RTCB, bac3错误, bac1错误(mCherry的基本序列有，但是插入了一段重复)

N-SLC7A5, bac1错误(mCherry不对)

N-THG1L, bac1错误(没有mCherry)

我大概明白为什么了，我在获得将GFP替换为mCherry的N-dTAG和C-dTAG标签序列时，用的是两步融合PCR，除了mCherry以外的FKBP-V, P2A, linker等的来源是PGEMT-ASW-N-dTAG-P2A-EGFP。等到下一步融合时，因为我刷小聪明，没有将第一步的PCR产物胶回收，而是直接作为模板投入overlap PCR的反应，而因为mCherry和GFP的两头序列是相同的，引物结合位点一致（更重要的是我还没有不加引物预先overlap）。所以产物中混入了大量从PGEMT-ASW-dTAG-P2A-EGFP中直接PCR下来的没有替换成mCherry的，原始的带有EGFP的N-dTAG和C-dTAG标签。啊！！耽误一周多时间！又要从头开始了！

看来遵守标准protocol很重要啊！我偷的这几分钟懒，耽误的一个多星期，足够未来所有勤勤恳恳标准实验的额外付出的时间了！
2025.9.11

2025.9.9 sgRNA质粒全军覆没了，发现引物选错5’和3’overhang了，重新买了引物，重新做了GoldenGate。

2025.9.10 对C-ATAD5, C-ELOF1, C-PTPN1, C-RAD51, C-RTCB, C-TYMS这几个PGEMT重新做了PCR和连接，并且送样测序了。

2025.9.11重新获得N-dTAG和C-dTAG的标签序列：

for N-dTAG，以mCherry-F, P2A-mCherry-R为引物PCR，得到mCherry-P。以P2A-F, Linker-R引物PCR，得到P-F-L。mCherry-P和P-F-L融合PCR（引物mCherry-F, Linker-R）。严格切胶回收、不加引物预P。

for C-dTAG，以Linker-F, P2A-R为引物PCR，得到L-F-P。以mCherry-P2A-F（这里存在明显的命名错误，可能是当初错误的原因）, mCherry-R为引物PCR，得到P-mCherry。L-F-P和P-mCherry融合PCR（引物Linker-F, mCherry-R）。严格切胶回收、不加引物预P。

2025.9.19 sgRNA质粒除了C-PTPN1-sg都测序正确并且提质粒了。

2025.9.24

菌液PCR

送测了:

N-ABL1-bac6,8,12
N-ATAD5-bac6,11,12
N-ELOF1-bac6 (这个菌P只对了一半，但是测一下试试)
N-PTPN1-bac6,12,13
N-RAD51-bac8,9
N-RTCB-bac13
N-SLC7A5-bac7,9
N-THG1L-bac9,13
C-ABL1-bac7,11,12 (这3个菌P只对了一半，但是测一下试试)
C-ATAD5-bac7,9,10,13
C-ELOF1-bac8,9,11,13
C-PTPN1-bac6,8,9,12
C-RAD51-bac12
C-RTCB-bac9 (这个菌P只对了一半，但是测一下试试)
C-SLC7A5-bac7,8,9,11
C-THG1L-bac10
C-TYMS-bac8

2025.9.25

查看测序结果：

N-ABL1-bac6(错误, mCherry有一个氨基酸突变), bac8(正确, mCherry差几十bp没有测通), bac12(有错义突变)
N-ATAD5-bac6(错误，有片段插入), bac12(错误，有提前终止突变，太可惜了), bac11(基本正确, 需加测)
N-ELOF1-bac6(错误，缺片段)
N-PTPN1-bac6(错误, 有片段插入), bac12(错误，有提前终止突变), bac13(错误，有提前终止突变)
N-RAD51-bac8(错误，有提前终止突变), bac9(错误，有提前终止突变)
N-RTCB-bac13(基本正确, 需加测)
N-SLC7A5-bac7(错误，有提前终止突变), bac9(错误，有提前终止突变)
N-THG1L-bac9(错误，有提前终止突变), bac13(错误，有提前终止突变)
C-ABL1-bac11(错误), bac7(需加测), bac12(需加测)
C-ATAD5-bac7(错误，没连上), bac9(基本正确，差几十bp没有测通), bac10 (target可能不对), bac13(需要加测)
C-ELOF1-bac9(错误), bac11,13(需加测)
C-PTPN1-bac8(测序质量差，舍弃), bac9(需要加测并判断左侧突变是否影响Exon氨基酸序列), bac12(需要加测并判断左侧突变是否影响Exon氨基酸序列), bac6(错误, 有错义突变)
C-RAD51-bac12(需要加测)
C-RTCB-bac5(需要加测), bac9(错误)
C-SLC7A5-bac7,8,9,11(下游接缝都错误,检查了一下竟然是THG1L的序列, 不知道是测序公司搞混了还是我搞混了, 换一家公司再测一次)
C-THG1L-bac10(下游序列有问题，检查了一下竟然是SLC7A5的序列, 不知道是测序公司搞混了还是我搞混了, 换一家公司再测一次)
C-TYMS-bac8(错误, FKBP-P2A没连上, pDSRED-N1-R这条引物读穿了，说明是构建过程出错了)

对N-ABL1-bac6,bac8, N-ATAD5-bac5,bac11, N-RTCB-bac13, C-ABL1-bac7,bac12, C-ATAD5-bac5,bac9,bac13, C-ELOF1-bac5, bac11,bac13, C-PTPN1-bac9,bac12, C-RAD51-bac12, C-RTCB-bac5提质粒测序（下单新的针对性的测序引物）

新的测序引物设计：

N-ABL1-bac6, bac8用P2A-R(已有)测序,
N-ATAD5-bac11用P2A-R(已有)测序,
N-RTCB-bac13用P2A-R(已有)测序,
C-ABL1-bac7, bac12用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,
C-ATAD5-bac5, bac9, bac13用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,
C-ELOF1-bac5用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,
C-PTPN1-bac9, bac12用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,
C-RAD51-bac12用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,
C-RTCB-bac5用mCherry-R(已有), mCherry-midF测序,

mCherry-midF: CCTGAAGGGCGAGATCAAGC

以下需要重新构建：

N-ELOF1, N-PTPN1, N-SLC7A5, N-THG1L，因为测序结果中出现大比例的P2A上的pre-stop突变，说明是PCR早期引入，需要更换PCR酶重新PCR、连接。
N-TYMS，原先因为片段没P出来放弃了，这次一波带上。
C-SLC7A5, C-THG1L, C-TYMS，因为前两者片段有交叉污染，不排除引物层面就标错了，重新下单；后者片段没连上，可能构建流程操作错误。

为避免错误，原来的片段和中间产物都丢弃，重新买引物构建。

2025.9.26

发现N-ATAD5-bac11正确概率极大，N-ATAD5-bac5还未测通，就先不提了，菌液暂存；

发现C-ATAD5-bac5,9,13都大差不大，应该都对，只提C-ATAD5-bac9,13，先不提C-ATAD5-bac5，菌液暂存，减小工作量；

发现C-ELOF1-bac5正确概率极大，只提C-ELOF1-bac5, 先不提C-ELOF1-bac11,13，减小工作量；

N-ELOF1, N-PTPN1, N-SLC7A5, N-THG1L, N-TYMS构建方案（Linker处GC含量太高，做了同义密码子替换）：

multiplex克隆出基因组片段（N-TYMS重新设计nested引物，其他用原来的）
以基因组片段为模板，5926target-N-ELOF1-F 和 5926mCherry-NELOF1-R为引物PCR得到 left arm，
以构建好的N-dTAG质粒为模板，mCherry-F, 5926linker-R为引物得到N-dTAG插入片段（Linker同义替换密码子）
以基因组片段为模板，5926N-ELOF1-rightF 和 5926target-NELOF1-rightR 为引物PCR
N-dTAG和right arm融合PCR，引物是mCherry-F 和 5926MCS-NrightR，产物2256bp。
第5步产物与第2步产物融合PCR，引物是5926MCS-target-F 和 5926MCS-NrightR，产物3309bp，与PGEMT vector单片段无缝克隆。

N-PTPN1-left上游引物区域太高GC了，我截短了约50bp，用于得到一个适中的PCR引物；N-THG1L-left也截短了，因为太低GC。注意全程touchdown和维持高温退火，有几个避无可避的极高GC引物。

C-SLC7A5, C-THG1L, C-TYMS构建方案（Linker也做了同义替换，不过跟N-dTAG中的位置不同）

multiplex克隆出基因组片段
以基因组片段为模板，5926target-CTHG1L-leftF 和 5926CLinker-CTHG1L-leftR为引物PCR得到left arm
以构建好的C-dTAG质粒为模板，5926-CLinker-F 和 mCherry-R 为引物PCR得到C-dTAG插入片段（Linker同义替换密码子）
以基因组片段为模板，5926mCherry-CTHG1L-righF 和 5926target-CTHG1L-rightR 为引物PCR
left arm和C-dTAG融合PCR，引物是5926MCS-target-F 和 mCherry-R，产物2218 bp
第5步产物与第4步产物融合PCR，引物是5926MCS-target-F 和 5926MCS-NrightR，产物3271 bp

C-TYMS-right 和 C-SLC7A5-right 也截短了一些，便于设计引物。

2025.9.27 查看测序结果

我应当优先查看至今还没有基本正确的construct以节省时间：N-ELOF1, N-PTPN1, N-RAD51, N-SLC7A5, N-THG1L, N-TYMS, C-SLC7A5, C-THG1L, C-TYMS.

N-ELOF1-bac21 (错误, 唯独有个P2A的UAG突变)
N-RAD51-bac15,16,17(全错误, 都有P2A上的UAG突变)
N-SLC7A5-bac15, 17, 19, 20 (全错误, 都有P2A上的突变), bac18 (基本正确, 需加测, 注意序列存在大量单碱基突变，但所有克隆都有，有10处影响到Exon的氨基酸序列，分别是A>V, A>S, S>R, S>A, T>A, V>M, E>D, I>V, T>S, L>H）
N-THG1L-bac14,19 (全错误,都有P2A上的UAG突变)
C-THG1L-bac15, 17(错误, 还是跟SLC7A5序列互换的问题，已下单重新构建的引物)

所以，对N-SLC7A5-bac18提质粒，用mCherry-midF加测。

注意到它存在大量单碱基突变，但所有克隆都有，应该是K562实际基因组序列与参考基因组不一致，或PCR到假基因所致。用一代测序产物在homo sapiens的genome做了Blast，发现确实匹配到假基因上去了。

序列匹配到99%的”SLC7A5P1″和99%的”SLC7A5-P2″和97%的”SLC7A5″……这仨序列也太太太像了……

那我可能需要考虑引物特异性的问题了。以及check一下C-SLC7A5存不存在脱靶到假基因的问题。

2025.9.27 查看测序结果

N-ABL1-bac8正确，已测通，保留质粒。（N-ABL1-bac6发现一个原来没注意的氨基酸突变，扔掉质粒）

N-ATAD5-bac11正确，已测通，保留质粒。

N-RTCB-bac13正确，已测通，保留质粒。

C-ABL1-bac7正确，已测通，保留质粒。（bac12也没问题，留着，但是之后统一用C-ABL1-bac7）

C-ATAD5-bac9正确，已测通，保留质粒。（bac13也没问题，留着，但是之后统一用C-ATAD5-bac9）

C-ELOF1-bac5正确，已测通，保留质粒。

C-PTPN1-bac9正确，已测通，保留质粒（在intron有一个单碱基突变，应该无关紧要）。（C-PTPN1-bac12错误，有片段插入，丢弃质粒）

C-RAD51-bac12正确，已测通，保留质粒

C-RAD51-bac12上有零散的多处突变，也需要blast一下看有没有假基因（结果并没有blast到别的位置，这段突变都在intron，我觉得没问题了）。

C-RTCB-bac5的mCherry上有一个G>S突变，而且貌似有双峰，还是再挑菌测几个比较好（不过如果mCherry能表达发光，其实也没事）。

2025.9.28 现在开始设计N-SLC7A5能够避开两个假基因（SLC7A5P1, SLC7A5P2）的构建方法，首先检查了一下原来用的两对从基因组PCR的引物。

N-SLC7A5-multiF2和N-SLC7A5-multiR2确实精确匹配到3个地方，产物大小也几乎完全一致，所以这对引物不能区分假基因（multiF1&R1靶向的地方更多）

用Primer-blast设计了一下，都不太好用呢，干脆用已经有的N-SLC7A5-multiF1和N-SLC7A5-multiR2吧，这个blast一下看，还好一丢丢：

后来对multiF2和R1这对blast了一下，也比原来的F1&R1 / F2&R2要特异性好一些。看来不能随随便便multiplex PCR啊，这个副作用应该专门笔记一下。所以我就不用买新的引物了，直接用F1&R2或F2&R1这两对即可，同时touchdown退火。

对N-TYMS-multiF4/R4和F5/R5和F5/R4和F4/R5分别做Primer-blast，特异性良好，可以multiplex；

N-ELOF1, N-RAD51, N-THG1L之前测序有突变，序列做blast，并没有靶向其他假基因，应该是实际序列和参考序列不一致导致。

除了N-SLC7A5和N-TYMS需重新从genome PCR，其他都可以复用第一次做的multiplex PCR产物了。

2025.9.28 PX458-mCherry-C-PTPN1-sg已核实，测序正确。