ChIP-seq Protocol

步骤 1: 细胞收集和交联

1. 在两个6孔板的孔中培养细胞至约80%的汇合度（~5million细胞），用室温1x PBS清洗一次，在37℃下用胰蛋白酶消化3分钟后，收集至2 mL低吸附管中，加入1 mL培养基。
2. 对收集到的细胞悬液进行细胞计数。对于NCCIT细胞系，根据细胞计数结果取用3 million细胞对应的体积的细胞悬液，室温离心收集。5分钟，200xg。
3. 离心时配置3% PFA in PBS（每1.5mL PBS加300μL 16% PFA，以达到最终3% PFA in PBS的浓度）。离心结束后，弃上清，用1.8mL 3% PFA in PBS重悬（先加900μL充分重悬后再加另外的900μL）。
4. 室温下，垂直旋转10分钟。
5. 过程中配置下一步需要的反应终止液（0.94g Glycine + 5mL H₂O）。

注意：1.5mL PBS + 300μL 16% PFA 的实际终浓度为 2.67%，但实验室习惯称呼为 3% PFA。

步骤 2: 终止交联

1. 加入180uL 2.5M甘氨酸，快速上下吹打3次，轻轻颠倒几次混合后，室温下垂直旋转10分钟。

提示：

• 2.5M 甘氨酸用于 3% PFA 交联，配方：0.94g 甘氨酸 + 5mL H₂O；
• 1.25M 甘氨酸用于 1% PFA 交联，配方：0.47g 甘氨酸 + 5mL H₂O。

步骤 3: PBS清洗

1. 离心5分钟， 4℃， 8000xg， 弃上清，加1 mL冷的1x PBS，Vortex混匀
   这里可以发现细胞沉淀死死黏在离心管底部，比较难Vortex起来，可以用手指头弹一弹帮助混匀。
2. 再次离心5分钟， 4℃， 8000xg， 弃上清，重悬于1 mL冷的1x PBS，Vortex混匀
   这里比上一步Vortex就轻松多了。
3. 再次离心5分钟， 4℃， 8000xg， 弃上清。

步骤 4: 裂解缓冲液LB1和LB2处理

1. 重悬细胞沉淀于2 mL冷的LB1缓冲液中，轻轻上下吹打后，4℃下垂直旋转10分钟。
2. 离心5分钟，8000xg，4℃，弃上清后用小枪头吸去残余液体
   这里沉淀粘附不强，需要很小心地吸弃上清
3. 重悬细胞沉淀于2 mL室温LB2缓冲液，轻轻上下吹打，室温下垂直旋转10分钟。
4. 离心5分钟，8000xg，4℃，弃上清后用小枪头吸去残余液体。
   这里沉淀粘附仍然不强，需要很小心地吸弃上清

步骤 5: 超声剪切DNA

1. 准备超声专用管。重悬细胞沉淀于301uL冷的Shearing Buffer 1 (with 0.3% SDS)中，轻轻上下吹打后转移到超声专用管，置于冰上
   有SDS容易产生气泡，可以用1mL移液枪悬空滴落，后用200μL移液枪缓慢捶打混匀、转移
2. 超声。超声参数： 振幅 85%，20秒开/40秒关，处理22分钟
   对于NCCIT细胞设置22min，实际加上暂停的时间一共是66min；对于K562需要设置25min
3. 每个超声后的样品转移至1.5 mL预冷管，加入602uLShearing Buffer 2（no SDS），离心10分钟，16000xg，4℃
   这里超声完管壁会有大量小水珠，需要对超声管瞬时离心一下再转移

步骤 6: 孵育抗体

1. 转移上清液（约900uL）至新的1.5 mL预冷管中，加入100uL 10% Triton X-100，混匀。
2. 取5μL至新的1.5mL低吸附离心管作为"input"，-20℃存放。
3. 剩余样品分成两个replicate，每份450μL。
4. 每个replicate中加入约5μg 抗体，混合后在4℃下垂直旋转12-16小时。

注意： 5μg 抗体是参考值，依不同抗体和蛋白而变化。

步骤 7: 准备Dynabeads并洗涤

1. 确定应使用哪种磁性Dynabeads（Protein A或Protein G）与各类抗体结合 [参阅Dynabeads手册中的抗体类型亲和力]。
2. 每个ChIP反应等分 50 µL Dynabead悬液（相当于 25 µL 磁珠）至置于冰上的1.5mL离心管中（这里指的是每个replicate）。
3. 在冰上用1 mL冷的Block Solution将Dynabeads洗涤3次：
   1. 加入 1 mL 冷的Block Solution，通过颠倒或轻弹混匀
   2. 放入磁力架，等待磁珠附着在侧壁
   3. 吸走液体，重复此过程
   4. 最后一次洗涤时，用小枪头移除所有液体

步骤 8: 抗体结合

1. 将所有约 0.45 mL 抗体结合的染色质（就是上一步4℃孵育的样品）加入已洗涤的磁珠中，颠倒混合。
2. 在 4℃ 下垂直旋转至少 2-4小时，使抗体结合到磁珠上。

步骤 9: 洗涤结合的磁珠

1. 冰上冷却RIPA Wash Buffer，并将水浴设置为 65℃。
2. 用 1 mL 冷的RIPA至少洗涤结合的磁珠3次：
   1. 加入 1 mL 冷的RIPA，颠倒或轻弹混匀
   2. 放入磁力架，等待磁珠附着在侧壁
   3. 吸走液体，重复此过程
   4. 最后一次洗涤时，用小枪头移除所有液体
      因为有NP-40，RIPA Wash Buffer有一点点粘，所以用大枪吸完后会有一些管壁上的液体慢悠悠再落到管底部，这时再用小枪头吸干（不要大枪头下面戳一个小枪头只吸一次，那样还是会有残留）。
3. 在冰上用 1 mL 含 50 mM NaCl 的TE Buffer洗涤磁珠1次，放入磁力架，等待磁珠附着在侧壁后吸走液体。
   用5M NaCl和TE Buffer现配现用。用TE+NaCl洗的时候，明显感觉不像前面RIPA Wash Buffe那样颠倒几次就能混匀了，一些beads比较牢固地粘在底部。

步骤 10: 洗脱染色质

1. 在 4℃ 下以 950 x g 离心 3分钟，用小枪头移除所有剩余的TE Buffer。
2. 加入 200 µL 室温的Elution Buffer，短暂vortex混合。
3. 在 65℃ 的恒温混合器（Eppendorf Thermomixer C）中孵育 15分钟，速度为 1000 rpm。
4. 瞬时离心 10秒防止管盖上有残余的样品，将磁珠放入磁力架中。
5. 磁珠完全贴壁后，将上清液（约 200 µL）转移到新的1.5mL离心管中。

步骤 11: 解交联

1. 从 -20℃ 将 "input" 样品解冻至室温，加入Elution Buffer至 200 µL 体积，并通过短暂vortex混合。
2. 在 65℃ 恒温混合器（Eppendorf Thermomixer C）中孵育ChIP/input样品过夜（ 12-16小时），速度为 300 rpm，以解交联。

步骤 12: 稀释SDS和添加RNase A

1. 在室温下每管加入 1倍体积（200 µL） TE Buffer（以稀释SDS），并Vortex混合。
2. 加入 8 µL 浓度为 10 mg/mL 的RNase A，使其终浓度为 0.2 mg/mL，并Vortex混合。
3. 在 37℃ 的水浴或恒温混合器（Eppendorf Thermomixer C）中孵育 2小时，速度为 300 rpm，以消化RNA。

步骤 13: 添加CaCl₂和Proteinase K

1. 加入 7 µL 浓度为 300 mM 的CaCl₂，使其终浓度达到 5.25 mM，并Vortex混合。
   这里氯化钙加完会形成一小层细密的白色沉淀，但很容易混匀，而且混匀后不会再沉下来。
2. 加入 4 µL 浓度为 20 mg/mL 的Proteinase K，使其终浓度为 0.2 mg/mL，并Vortex混合。
3. 在 55℃ 的水浴或恒温混合器（Eppendorf Thermomixer C）中孵育 0.5-2小时，以消化蛋白质。
   张涛说1h就可以，他每次都精准孵育1h。

步骤 14: 酚-氯仿提取DNA

使用heavy phase-lock tubes在室温下进行酚-氯仿提取DNA [请参照heavy phase-lock tubes的protocol]。

1. 按照说明离心 phase-lock tubes（13200 rpm室温离心30s），向每个管中加入 400 µL 样品。
2. 加入 1倍体积（400 µL） 25:24:1的酚-氯仿-异戊醇，猛烈摇动至少50次混匀。
   注意是DNA的酚氯仿异戊醇（pH＞7.8），还有一种pH＜5的是用于RNA的。
3. 以 13200 rpm 的速度在室温下离心 5分钟 以分离层次。
4. 将 400 µL 氯仿加入水相，猛烈摇动50次。
5. 再次以 13200 rpm 的速度在室温下离心 5分钟。
6. 将上层水相转移至新的低吸附离心管中。
   这两步剧烈震荡完都会看到大量白色泡沫，离心后变澄清。加酚氯仿异戊醇和氯仿的时候，都需要先吸一枪再吐回去润一下枪头，不然会自动往下滴，可能导致加样体积不准。润过之后就不往下滴了。

步骤 15: 乙醇沉淀DNA

1. 在冰上进行DNA的乙醇沉淀 [参阅伴随协议]。按以下顺序添加试剂：
   1. 加入 1.5 µL 浓度为 20 mg/mL 的Glycogen。
   2. 加入 1/10体积（约40 µL） 3M NaOAc，Vortex混合并快速离心。
   3. 加入 2.7倍体积（约1080 µL） 冰冷的100%乙醇，颠倒15次混匀。
   
   总体积刚好1521.5μL，实际上样品吸不出来400μL。有人喜欢加3倍体积乙醇，这里一定得是2.7倍，除非你用2mL的离心管。糖原和NaAc可以预混，但是乙醇一定要最后加。
2. 在-80℃ 孵育 1小时 或在-20℃ 过夜孵育，以沉淀DNA。
   尽量别用-80℃ 1h，最好是-20℃过夜。也别-80℃过夜，因为-80℃会结冰可能影响醇沉效果。

步骤 16: 离心和洗涤DNA沉淀

1. 以 13200 rpm 的速度在 4°C 下离心 45分钟，以沉淀DNA（可见小的白色沉淀）。
2. 使用小枪头小心去除上清液，只留沉淀物。
3. 加入 0.5 mL 冰冷的75%乙醇，翻转或弹击以重悬（确保沉淀不粘附在溶液上方的任何区域，否则难以再次沉淀至管底）。
4. 以 13200 rpm 的速度在 4°C 下离心 15分钟，再次沉淀DNA（小的白色沉淀）。
5. 吸弃乙醇，并使用小枪头小心去除剩余的液体，只留沉淀物。
6. 在室温下空气干燥沉淀约10分钟，直到沉淀变为透明。

步骤 17: 重悬DNA沉淀

将沉淀重悬在所需体积的无菌蒸馏水（dH₂O）中，放入恒温混合器（Eppendorf Thermomixer C）中，在 37°C 下以 1100 rpm 的速度溶解 1分钟：
input = 25 µL，ChIP样品 = 25 µL

步骤 18: 测定DNA浓度

通过Qubit测定DNA的浓度。

步骤 19: 构建文库或保存DNA

构建测序文库，或者将DNA存储在 -20°C 直到需要进行后续步骤。

1. 末端修复

1. 准备八联排管，每管内预混 End Prep Buffer 3.5μL + End Prep Enzymes 1.5μL + Damaged DNA Repair Enzymes 1.5μL。
2. 对于Input样品，取30ng 加入上述体系，再用水补足至总体积 30μL。
3. 对于其他Elute样品，取 23.5μL 加入上述体系，总体积同样为 30μL。
4. 进行末端修复程序：30℃, 30min → 65℃, 30min → 4℃ , ∞。

2. 接头连接

1. 根据投入DNA的质量来决定接头的稀释倍数：
   • 对于 30ng Input，用 Low-EDTA TE 稀释 2倍。
     
   • 对于 IP 的 Elute，浓度在 42.6 ng/µL ~ 2.1 ng/µL 范围内的无需稀释；2.1 ng/µL ~ 1.1 ng/µL 稀释 2倍；1.0 ng/µL ~ 0.4 ng/µL 稀释 5倍；0.4 ng/µL ~ 0.2 ng/µL 稀释 10倍；< 0.2 ng/µL 稀释 20倍。
2. 准备接头连接反应体系（单个样本）：End Prep Reaction Mix 30 µL，Ligation Buffer 15 µL，ddH₂O 2.5 µL，Ligation Enzymes 5 µL，Working Adaptor 2.5 µL，总体积 55 µL。
3. 反应程序为 22℃，15 分钟，PCR 仪不设热盖。

3. 磁珠纯化

1. 每个样本中加入 44μL (0.8X) Agencourt™ Ampure XP Beads 并混匀后，在 室温 下孵育 5分钟。
2. 将PCR管放置于磁力架上静置 2分钟，待溶液澄清后小心移除上清液。
3. 使用 100μL 80%乙醇漂洗磁珠，孵育 30秒 后再移除上清，并重复此漂洗步骤一次。
4. 保持PCR管在磁力架上，用 10μL 移液器吸走管底残留的乙醇，并打开管盖使磁珠干燥直至无乙醇残留。
5. 最后，在 10.5μL Low-EDTA TE Buffer中重悬磁珠，室温 静置 1分钟 后，再次置于磁力架上静置 2分钟，然后转移 10μL 上清液至新的PCR管。

4. PCR扩增

1. 准备PCR反应混合物，包含 5 μL 接头连接的DNA、6.25 μL 2X PCR Master Mix 和 1.25 μL Dual Index Primers，总体积 12.5 μL。
2. 进行以下热循环：98℃预变性1分钟；随后是 98℃ 10秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，共2至17个循环（Input 5个循环，Elute 12个循环）；最后 72℃延伸1分钟，保持在 12℃。

1. 准备1%琼脂糖凝胶，取1μLPCR产物电泳检测PCR结果，对产量不足的样品增加PCR循环次数。
2. 加完循环数后再取1μL跑胶确认产量。

5. 第二次磁珠纯化

1. 每个样本中加入 10.5μL / 11.5μL (1X) Agencourt™ Ampure XP Beads 并混匀后，在 室温 下孵育 5分钟。
2. 将PCR管放置于磁力架上静置 2分钟，待溶液澄清后小心移除上清液。
3. 使用 100μL 80%乙醇 漂洗磁珠，孵育 30秒 后再移除上清，并重复此漂洗步骤一次。
4. 保持PCR管在磁力架上，用10μL移液器吸走管底残留的乙醇，并打开管盖使磁珠干燥直至无乙醇残留。
5. 最后，在 15μL Low-EDTA TE Buffer 中重悬磁珠，室温 静置 1分钟 后，再次置于磁力架上静置 2分钟，然后转移 15μL 上清液至新的PCR管。

7. Qubit定量

对经过第二次磁珠纯化的样品进行Qubit定量，确保其浓度符合后续实验要求。