酶切产物自连

摘要:设计构克隆的时候突然想到这个以前没考虑过的问题。如果只有一个单一的具有粘性末端的序列,它是否会在DNA连接酶存在的条件下形成多聚体?做了一个简单的实验,发现确实会自连,而且概率并不低,如果充分反应,超过50%的片段会形成至少二聚化,部分甚至三聚化、四聚化……如下图所示:

形成多聚体的原因是,大部分常用的限制性内切酶的酶切识别位点是回文序列,所以形成的粘性末端(一般是4nt)可以和自身反向互补。比如上图中的SpeI的粘性末端是5′-ctag-3’,AgeI的粘性末端是5′-ccgg-3’,都是回文序列。

  • 如果两端都是回文粘性末端,会串联形成二聚体、三聚体、四聚体……
  • 如果只有一端是回文序列的粘性末端,另一端是非回文粘性末端或平末端,就只能头对头形成二聚体;
  • 如果两端都没有回文序列,就不会发生自连

下面是上图的实验细节

用2xM5 hiper plus taq通过PCR得到316bp片段,上下游分别含有SpeI和AgeI酶切识别位点。PCR体系400μL,程序结束后取5μL跑胶,条带正确。

PCR反应液用试剂盒回收、测浓度。77.2ng/μL,取34μL于新的PCR管,加5μL 10x FastDigest Buffer, 2μL FastDigest SpeI和2μL FastDigest AgeI,补7μL ddH2O至50μL体系,37℃酶切15min。

酶切结束后,反应液用试剂盒回收、测浓度,得到101.2ng/μL * 17μL.

这里可以稍作计算,酶切产物回收后一共有101.2ng/μL * 17μL = 1720.4 ng,投入的DNA底物的量为77.2ng/μL * 35μL = 2702ng,回收效率大概是1720.4 / 2702 = 63.7%. 假设从PCR反应液中回收的效率相同,那么PCR反应液中的目的片段DNA总量为2702 / 63.7% = 4241.8ng,浓度为4241.8ng / 400μL = 10.6ng/μL. PCR样品跑胶时,上样了5μL,就是 10.6ng/μL * 5μL = 53ng. 所以53ng足以在上图的小孔1.5% Agarose Gel上得到较为清晰的条带。

而最后的连接体系中,Fragment1投入了101.2ng/μL * 4μL = 404.8ng,全部上样可能条带过粗不易分辨大小,而上一段可能高估试剂盒胶回收效率,而且结果可能并不是单一条带,所以也不能上样太低。综合考虑可以上样250ng,即250ng / 404.8ng * 25μL = 15.4μL.

由于需要在上样前加十分之一的10x loading buffer,所以最后需要上样15.4 / 0.9 = 17.1μL,不过最后实际上样时,发现,那个孔装不下17.1μL,每个都漏了大概3μL,可能造成交叉污染。

组别Fragment1(SpeI&AgeI粘性末端(101.2ng/μl,约306bp)Fragment2(AgeI & SphI粘性末端(20.2ng/μl,约501bp)2xligation buffer (C671A)T4 DNA ligase (M180A)ddH2O总体积
14μL12.5μL8.5μL25μL
24μL12.5μL1μL7.5μL25μL
34μL7.5μL12.5μL1μL25μL
44μL7.5μL12.5μL1μL25μL
连接体系

25℃反应75min

看样子是Fragment2的浓度太低了,导致它的条带根本看不见。所以组1和组3、组2和组4的条带类型一模一样。但仍然能够看出,组2单片段发生了自连,而且这种自连是可以发生不止一次的,生成串联的条带。除了306bp的整倍数条带,中间还夹杂了一些微弱条带,可能是环状DNA。

衍生假设:

  1. 单酶切载体和双酶切载体,都会发生自连。如果选择非常靠近的两个酶进行单酶切或双酶切,再将酶切产物用T4 ligase连接,产物条带应该完全相同。(在粘性末端氢键数量相同的情况下);
  2. 非回文序列的黏性末端不会发生自连;
  3. 如果片段的一端为回文序列粘性末端,另一端为平末端或非回文序列黏性末端,将只能发生一次自连。只得到两倍大小的连接产物,没有3倍、4倍……或成环的产物。

对于构建克隆的指导:

  1. 尽量不要进行超过2个片段的连接,每多一个片段,连接效率都会断崖式下降;
  2. 进行2个片段以上的连接时,说明书上的片段大小和摩尔比要严格遵守。
  3. 一般来讲,T4 ligase的商业说明书会建议,越小的片段的摩尔数要越高。我以前理解它的原因是“T4 ligase会优先结合大片段”,但现在看来原因也许不是这样,小片段的分子自由碰撞概率更高,应该被T4 ligase结合概率更大才对。但这个摩尔比的考虑我还没有想清楚。

还是上面的306bp片段,如果只单酶切的话,因为只有一侧有反向互补的回文粘性末端,所以只形成“二聚体”,如下图(2% Agarose胶):