酶切产物自连

摘要：设计构克隆的时候突然想到这个以前没考虑过的问题。如果只有一个单一的具有粘性末端的序列，它是否会在DNA连接酶存在的条件下形成多聚体？做了一个简单的实验，发现确实会自连，而且概率并不低，如果充分反应，超过50%的片段会形成至少二聚化，部分甚至三聚化、四聚化……如下图所示：

形成多聚体的原因是，大部分常用的限制性内切酶的酶切识别位点是回文序列，所以形成的粘性末端（一般是4nt）可以和自身反向互补。比如上图中的SpeI的粘性末端是5′-ctag-3’，AgeI的粘性末端是5′-ccgg-3’，都是回文序列。

• 如果两端都是回文粘性末端，会串联形成二聚体、三聚体、四聚体……
• 如果只有一端是回文序列的粘性末端，另一端是非回文粘性末端或平末端，就只能头对头形成二聚体；
• 如果两端都没有回文序列，就不会发生自连

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下面是上图的实验细节

PCR反应液用试剂盒回收、测浓度。77.2ng/μL，取34μL于新的PCR管，加5μL 10x FastDigest Buffer, 2μL FastDigest SpeI和2μL FastDigest AgeI，补7μL ddH2O至50μL体系，37℃酶切15min。

酶切结束后，反应液用试剂盒回收、测浓度，得到101.2ng/μL * 17μL.

这里可以稍作计算，酶切产物回收后一共有101.2ng/μL * 17μL = 1720.4 ng，投入的DNA底物的量为77.2ng/μL * 35μL = 2702ng，回收效率大概是1720.4 / 2702 = 63.7%. 假设从PCR反应液中回收的效率相同，那么PCR反应液中的目的片段DNA总量为2702 / 63.7% = 4241.8ng，浓度为4241.8ng / 400μL = 10.6ng/μL. PCR样品跑胶时，上样了5μL，就是 10.6ng/μL * 5μL = 53ng. 所以53ng足以在上图的小孔1.5% Agarose Gel上得到较为清晰的条带。

而最后的连接体系中，Fragment1投入了101.2ng/μL * 4μL = 404.8ng，全部上样可能条带过粗不易分辨大小，而上一段可能高估试剂盒胶回收效率，而且结果可能并不是单一条带，所以也不能上样太低。综合考虑可以上样250ng，即250ng / 404.8ng * 25μL = 15.4μL.

由于需要在上样前加十分之一的10x loading buffer，所以最后需要上样15.4 / 0.9 = 17.1μL，不过最后实际上样时，发现，那个孔装不下17.1μL，每个都漏了大概3μL，可能造成交叉污染。

组别	Fragment1(SpeI&AgeI粘性末端（101.2ng/μl，约306bp）	Fragment2(AgeI & SphI粘性末端（20.2ng/μl，约501bp）	2xligation buffer (C671A)	T4 DNA ligase (M180A)	ddH2O	总体积
1	4μL	–	12.5μL	–	8.5μL	25μL
2	4μL	–	12.5μL	1μL	7.5μL	25μL
3	4μL	7.5μL	12.5μL	–	1μL	25μL
4	4μL	7.5μL	12.5μL	1μL		25μL

25℃反应75min

看样子是Fragment2的浓度太低了，导致它的条带根本看不见。所以组1和组3、组2和组4的条带类型一模一样。但仍然能够看出，组2单片段发生了自连，而且这种自连是可以发生不止一次的，生成串联的条带。除了306bp的整倍数条带，中间还夹杂了一些微弱条带，可能是环状DNA。

衍生假设：

1. 单酶切载体和双酶切载体，都会发生自连。如果选择非常靠近的两个酶进行单酶切或双酶切，再将酶切产物用T4 ligase连接，产物条带应该完全相同。（在粘性末端氢键数量相同的情况下）；
2. 非回文序列的黏性末端不会发生自连；
3. 如果片段的一端为回文序列粘性末端，另一端为平末端或非回文序列黏性末端，将只能发生一次自连。只得到两倍大小的连接产物，没有3倍、4倍……或成环的产物。

对于构建克隆的指导：

1. 尽量不要进行超过2个片段的连接，每多一个片段，连接效率都会断崖式下降；
2. 进行2个片段以上的连接时，说明书上的片段大小和摩尔比要严格遵守。
3. 一般来讲，T4 ligase的商业说明书会建议，越小的片段的摩尔数要越高。我以前理解它的原因是“T4 ligase会优先结合大片段”，但现在看来原因也许不是这样，小片段的分子自由碰撞概率更高，应该被T4 ligase结合概率更大才对。但这个摩尔比的考虑我还没有想清楚。

还是上面的306bp片段，如果只单酶切的话，因为只有一侧有反向互补的回文粘性末端，所以只形成“二聚体”，如下图(2% Agarose胶)：