Knock-In的FACS Gates怎么画

FACS技术在敲入细胞系构建中的应用

流式细胞术（FACS）是一种精准的细胞分选技术，通过细胞的荧光特性，快速有效地筛选出具有特定标记的细胞。在构建敲入细胞系时，通常采用双sgRNA介导的同源定向修复（HDR）方法时。该方法通常会在目标基因的同源臂上标记荧光蛋白（如GFP），从而可以直观检测基因整合的成功与否。

两轮FACS筛选：从富集到精筛

正式筛选前通常会进行两轮FACS。第一次筛选是在转染后48小时进行，目的是富集所有GFP阳性细胞，得到一个称为“population”的细胞群体。这些细胞可能包括所有成功转染但尚未整合的细胞，因此这一轮FACS主要是捕获所有潜在的阳性细胞。

接下来，将这些细胞继续培养7天，在此期间未整合的转染片段会逐渐丢失，成功整合的细胞则会稳定下来。此时，进行第二轮FACS筛选。

在第二轮FACS过程中，重点关注GFP阳性细胞中的荧光强度差异。人类细胞通常是二倍体的，即拥有两套染色体。要实现纯合敲入，目标基因必须整合到这两套染色体中。在实验室中使用的癌细胞中，染色体的套数甚至可能超过两套（即多倍体）。由于荧光强度与基因整合事件的数量相关，最终的gates应设置为选择荧光最强的5%细胞。这些细胞更可能成功整合多个基因拷贝，从而提高纯合敲入的成功率。通常需要打至少3块96孔板，因为并非所有的单克隆都能顺利生长。从单细胞到足够数量以进行基因分型的过程通常需要15天，而能够成功生长的单克隆通常仅占打板细胞的20%左右。

基因型鉴定：PCR验证整合效果

利用FACS筛选出目标细胞后，接下来需要通过PCR进行基因分型，以确认基因敲入的成功。为此，在插入序列两端（同源臂）设计引物。通过PCR扩增，可以获得两个不同大小的条带：未整合的染色体会生成较小的条带，而整合了插入序列的染色体会生成较大的条带。

为确保结果的准确性，最好使用包含野生型（WT）、半合子和纯合子细胞的混合样本作为对照。这样可以验证引物性能，并通过PCR结果有效区分出不同基因型。

踩过的坑：选择最亮的细胞！

尽管前面的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）参数已经排除碎片、死细胞等低质量样本，我仍担心GFP-positive分群中有质量较低的细胞（通常带有自发荧光），因此我将排序门限避开了最亮的5%，而是选择了亮度在5%到15%之间的细胞。

然而，这一决定导致大多数排序出的细胞是杂合子的结果，即目标基因只整合到了一套染色体中。

我的好师兄Alan做过对比实验，证明选择最亮的5%细胞可以显著提高获得纯合敲入的成功率。

这次经验告诉我们，虽然对细胞群体的担忧是合理的，但最好在前面的质量门限中加强筛选条件，而不是在最后的选择门限上妥协。最后一个门限应设置为捕捉具有最高GFP强度的前5%细胞，以最大化选择出成功整合事件最多的细胞。