K562细胞系中UPR诱导中TG和TM的浓度和持续时间研究报告

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执行摘要

本报告旨在深入探讨在K562人髓系白血病细胞系中诱导未折叠蛋白反应（UPR）所需的硫普西加（Thapsigargin, TG）和衣霉素（Tunicamycin, TM）的浓度与持续时间，并特别关注XBP1剪接作为UPR激活的关键指标。UPR是细胞应对内质网（ER）应激的关键细胞稳态机制，内质网应激的特征是内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白的积累。

尽管现有文献中直接针对K562细胞的精确数据有限，但研究证实TG和TM均能有效诱导K562细胞的XBP1剪接和UPR激活，尤其是在8小时的暴露窗口期内。通过对其他经过充分表征的人类细胞系数据的推断，建议硫普西加的有效浓度范围为500 nM至1 µM，衣霉素为4-5 µg/mL，通常持续8-12小时。

本报告强调了由于细胞系特异性反应以及UPR的双相性质（即在长时间或严重应激下，UPR可能从适应性、促生存程序转变为促凋亡通路），进行经验性优化至关重要。理解这些参数对于白血病发病机制的研究以及靶向治疗策略的开发具有重要意义。

1. 未折叠蛋白反应 (UPR) 简介

1.1 内质网应激与UPR通路

内质网（ER）是真核细胞中一个至关重要的细胞器，主要负责分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折叠、修饰和质量控制 ¹。当内质网的蛋白质折叠能力被超负荷，导致未折叠或错误折叠的蛋白质在腔内积累时，就会发生内质网应激 ³。这种扰动可由多种生理和病理刺激引起，包括营养剥夺、缺氧以及细胞毒性化合物的作用 ³。

为了应对内质网应激，细胞会激活一个高度保守的适应性信号网络，即未折叠蛋白反应（UPR）。UPR旨在通过降低整体蛋白质合成、增加内质网伴侣蛋白和折叠酶的产生以及促进错误折叠蛋白质的降解来恢复内质网稳态 ²。UPR由三种主要的内质网跨膜蛋白感受器介导：肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）¹。每个感受器都会启动独特但相互关联的信号通路，以减轻内质网应激。虽然UPR主要是一种促生存机制，但长时间或未解决的内质网应激可能导致适应性机制的失效，从而触发细胞死亡程序，通常被称为终末UPR或内质网应激诱导的细胞凋亡 ⁴。

1.2 IRE1-XBP1轴：UPR的核心信号分支

在三种UPR分支中，IRE1-XBP1轴是介导内质网应激适应性反应的高度保守且关键的通路 ¹。当未折叠蛋白质在内质网腔内积累时，IRE1α（IRE1的哺乳动物同源物）会发生二聚化和寡聚化，从而导致其反式自磷酸化并激活其胞质内切核酸酶结构域 ⁷。这种被激活的IRE1α内切核酸酶特异性地靶向并加工编码X-盒结合蛋白1（XBP1）的mRNA ¹。

1.3 XBP1剪接作为IRE1激活的标志

未剪接的XBP1 mRNA（XBP1u）在其编码序列中含有一个独特的26核苷酸（nt）内含子 ²。被激活的IRE1α会切除这个内含子，导致翻译移码。由此产生的XBP1剪接形式（XBP1s）编码一个强效且功能独特的转录因子 ¹。XBP1s随后转运到细胞核，在那里激活众多UPR靶基因的转录。这些基因参与增强内质网蛋白质折叠能力（例如，内质网伴侣蛋白）、促进内质网相关降解（ERAD）组分以及支持内质网生物发生和磷脂合成 ¹。

由于其对IRE1α激活的直接和特异性依赖，XBP1 mRNA剪接被广泛认为是IRE1介导的UPR激活的可靠分子指标 ³。XBP1剪接不仅是UPR的标志，它同时扮演着信号指示器和效应器的双重角色。研究表明，XBP1剪接是UPR的“标志” ³，也是IRE1核酸内切酶活性的“可靠报告器” ⁷。然而，剪接产物XBP1s自身是一个“强效转录激活因子” ²，能够“调节参与内质网应激反应和UPR的基因表达” ⁴。这意味着XBP1剪接不仅仅是被动地指示IRE1激活，而是UPR适应性转录重编程中一个主动且不可或缺的步骤。因此，观察XBP1剪接直接证实了IRE1通路的激活以及旨在恢复内质网稳态的关键基因程序的启动。这种整合的角色使其成为UPR研究中一个信息量丰富且全面的指标，因为它同时标志着应激信号和细胞响应。

2. K562细胞系在UPR研究中的应用

2.1 K562细胞的特性和相关性

K562细胞系是一种成熟的人类永生化髓系白血病细胞系，最初来源于一名处于急变期慢性髓系白血病（CML）患者的胸腔积液 ¹⁵。它在血液学癌症研究中被广泛用作模型系统 ¹⁵。K562细胞通常在补充有胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素和丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中培养 ¹⁶。它们表现出快速的增殖率，在对数生长期细胞密度大约每24小时翻倍 ¹⁷。

UPR在癌症生物学中，包括白血病，具有特殊的相关性。这是因为转化细胞由于快速增殖、代谢改变以及通常不利的微环境，经常经历蛋白质稳态的紊乱 ⁵。在癌细胞中，UPR可以发挥复杂且通常是双重的作用：最初作为一种促生存机制，支持肿瘤细胞的适应和对化疗的抵抗，但在严重或长时间的应激条件下，它可能转变为促凋亡通路，导致细胞死亡 ⁵。

K562细胞系作为白血病研究的重要模型，其UPR的精确诱导具有重要的治疗意义。K562细胞是一种人类白血病细胞系 ¹⁶。UPR在癌细胞（包括白血病细胞）中扮演着复杂且通常是促生存的角色，但在严重或长时间的应激下也能触发细胞死亡 ⁵。因此，在K562细胞中精确诱导UPR（和XBP1剪接）不仅对基础研究至关重要，而且对于理解白血病发病机制和开发新型治疗策略具有直接的转化意义。例如，如果治疗剂旨在诱导白血病细胞的终末UPR，那么最佳的TG/TM浓度和持续时间将是那些能将细胞推向凋亡而非仅仅激活适应性、促生存UPR的条件。这凸显了K562作为研究内质网应激治疗操纵的关键模型。

3. 硫普西加 (TG) 在K562细胞UPR诱导中的应用

3.1 作用机制及其对内质网钙稳态的影响

硫普西加（Thapsigargin, TG）是公认的强效内质网应激诱导剂 ³。其主要作用机制是特异性抑制肌浆网或内质网Ca2+ ATP酶（SERCA）泵 ³。通过阻断SERCA，TG阻止钙离子重新摄取到内质网腔内，导致内质网钙储存耗尽。这种内质网钙稳态的破坏会损害钙依赖性内质网伴侣蛋白（如钙网蛋白）的功能，这些伴侣蛋白对于新生多肽的正确折叠和加工至关重要 ³。由此导致的未折叠蛋白质积累随后触发UPR。

3.2 K562细胞中XBP1剪接的报告浓度和持续时间

在现有研究文献中，直接、精确量化用于诱导K562细胞XBP1剪接的硫普西加浓度数据非常有限。多项研究证实，硫普西加作为一种“真正的内质网应激诱导剂”，在K562细胞中导致了PARP裂解和细胞死亡，这些细胞经过了15小时 ¹⁹ 或18小时 ¹⁹ 的孵育。尽管在这些研究中检测到了XBP1 mRNA剪接，但并未明确指出用于这些观察的硫普西加具体浓度。一项关键研究明确指出，用硫普西加处理K562细胞8小时后，XBP1表达和剪接状态显示出“强烈的UPR激活” ⁹。然而，该实验中使用的硫普西加精确浓度同样未被提供。

3.3 其他人类细胞系的参考数据

鉴于K562细胞精确浓度数据的稀缺性，其他人类细胞系中进行的实验提供了宝贵的参考，有助于建立可能的有效范围。

在永生化人B细胞中，500 nM的硫普西加能有效诱导内质网应激，并观察到XBP1剪接作为其标志 3。在这些细胞中，UPR相关基因的表达在处理后8小时内大部分被诱导或抑制 3。

在多发性骨髓瘤细胞系（U266, H929, MM1s）中，使用了更高浓度的10 µM硫普西加，导致“早期XBP1剪接” 20。这表明剂量与反应之间存在关系，较高浓度可能引发更快或更强的剪接反应。

在Huh-7细胞中，1 µM的硫普西加（THA）被用于有效抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞，且无细胞毒性 4。然而，在这种特定的实验背景下（转导细胞），据报道IRE1-XBP1s通路在THA处理后被

下调 ⁴，这是一个重要的细微差别，表明UPR结果具有背景依赖性。

在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和Hep G2细胞的研究中，同样使用了1 µM的硫普西加，观察到XBP1剪接在数小时（MEFs）或6小时（Hep G2）后达到最大水平 1。

根据上述信息，可以推断K562细胞的最佳浓度范围。尽管K562细胞中缺乏直接的硫普西加浓度数据，但现有证据证实硫普西加确实能诱导K562细胞的XBP1剪接 ⁹。为了弥补这一数据空白，可以参考其他人类细胞系的数据来推断一个合理的工作范围。永生化B细胞中500 nM的浓度在8小时内诱导了XBP1剪接和普遍的UPR基因变化 ³，这一持续时间与K562细胞中观察到的“强烈UPR激活”相符 ⁹。而10 µM的浓度在骨髓瘤细胞中诱导了“早期剪接” ²⁰，这可能表明其作用更快或更显著。综合这些观察，对于K562细胞，建议起始浓度范围为

500 nM至1 µM，处理持续时间为 6-15小时，这很可能有效诱导XBP1剪接。较高浓度可能会导致更快或更强的反应，但也伴随着细胞毒性风险增加，因此必须仔细监测。因此，强烈建议对K562细胞进行经验性的剂量-反应和时间进程优化，以确定UPR诱导和细胞活力之间的最佳平衡。

表1：K562细胞及相关人类细胞系中硫普西加诱导XBP1剪接的浓度和持续时间总结

细胞系	硫普西加浓度	处理持续时间	观察到的XBP1剪接/UPR激活	备注	参考文献
K562	未明确	15 小时	检测到XBP1 mRNA剪接	导致PARP裂解和细胞死亡	¹⁹
K562	未明确	18 小时	检测到XBP1 mRNA剪接	导致PARP裂解和细胞死亡	¹⁹
K562	未明确	8 小时	强烈的UPR激活，Xbp1剪接		⁹
永生化人B细胞	500 nM	8 小时	检测到XBP1剪接	多数UPR相关基因在8小时内诱导/抑制	³
多发性骨髓瘤细胞	10 µM	早期	早期XBP1剪接	(U266, H929, MM1s)	²⁰
Huh-7	1 µM	未明确	IRE1-XBP1s通路下调	在转导细胞中观察到，可能具有背景依赖性；无细胞毒性	⁴
MEFs	1 µM	4 小时	XBP1完全剪接	磷酸化JNK激活早于XBP1剪接	²¹
Hep G2	1 µM	6 小时	XBP1剪接达到最大水平		¹
PBEC	低剂量	6 小时	XBP1剪接mRNA主要表达	用于维持动态范围，避免UPR靶基因表达在严重ER应激下达到饱和效应	¹⁴

4. 衣霉素 (TM) 在K562细胞UPR诱导中的应用

4.1 作用机制及其对N-糖基化的影响

衣霉素（Tunicamycin, TM）是另一种广泛使用的内质网应激药理诱导剂 ³。TM特异性抑制N-糖基化，这是在内质网中发生的一种关键的翻译后修饰 ³。通过阻止正确的糖基化，TM导致未糖基化和错误折叠的蛋白质在内质网腔内积累，从而触发内质网应激和UPR ³。

4.2 K562细胞中XBP1剪接的报告浓度和持续时间

与硫普西加类似，直接、精确的衣霉素浓度数据用于诱导K562细胞XBP1剪接的报告有限。一项研究明确指出，衣霉素通过半定量方法诱导K562细胞的XBP1剪接 ²²。然而，在该上下文中并未提供具体的浓度或持续时间。另一项关于K562细胞的研究提到，衣霉素处理8小时后，XBP1表达和剪接显示出“强烈的UPR激活” ⁹。该观察中使用的具体浓度也未详细说明。

4.3 其他人类细胞系的参考数据

在永生化人B细胞中，4 µg/mL的衣霉素诱导了内质网应激，导致XBP1剪接 ³。与硫普西加类似，基因表达的变化主要在8小时内观察到 ³。

在人呼吸道上皮细胞（Calu-3）中，使用了5 µg/ml的衣霉素，时间进程研究显示sXBP1 mRNA水平在12小时后增加了3倍以上，并在8小时时达到最大水平 13。HeLa细胞在用5 µg/ml衣霉素处理20小时后也显示出UPR激活 13。

HEI-OC1细胞（听觉细胞）在用5、50和100 µg/ml衣霉素处理0、12、24和48小时后，表现出剂量和时间依赖性的细胞死亡 23。

在多发性骨髓瘤细胞系（U266, H929, MM1s）中，使用了显著更高浓度的100 µM衣霉素，导致早期XBP1剪接 20。

在Huh-7细胞中，5 µg/mL的衣霉素（TUN）有效抑制了SARS-CoV-2进入宿主细胞，且无细胞毒性，并且与该背景下的THA不同，它未下调IRE1-XBP1s通路 4。

根据上述信息，可以推断K562细胞中衣霉素诱导的有效范围。尽管K562细胞中缺乏直接的衣霉素浓度数据，但研究证实衣霉素能诱导K562细胞的XBP1剪接 ⁹。其他人类细胞系的数据显示，4 µg/mL至5 µg/mL的浓度在8-12小时内有效 ³。骨髓瘤细胞中使用了更高的100 µM浓度 ²⁰。考虑到K562细胞是白血病细胞系，其他人类细胞系中使用的浓度，特别是较低的4-5 µg/mL，是一个合理的起始点。K562细胞中8小时的强烈UPR激活持续时间 ⁹ 与Calu-3细胞中观察到的动力学（8小时达到最大剪接）相符 ¹³。因此，

4-5 µg/mL 的衣霉素，处理 8-12小时，是诱导K562细胞XBP1剪接的有力候选方案，而更高浓度可能导致更严重的应激和细胞毒性 ²³。

表2：K562细胞及相关人类细胞系中衣霉素诱导XBP1剪接的浓度和持续时间总结

细胞系	衣霉素浓度	处理持续时间	观察到的XBP1剪接/UPR激活	备注	参考文献
K562	未明确	8 小时	强烈的UPR激活，Xbp1剪接		⁹
K562	未明确	未明确	诱导XBP1剪接	半定量方法检测	²²
永生化人B细胞	4 µg/mL	8 小时	检测到XBP1剪接	多数UPR相关基因在8小时内诱导/抑制	³
Calu-3	5 µg/ml	8 小时	sXBP1 mRNA达到最大水平	sXBP1 mRNA在12小时后增加>3倍	¹³
HeLa	5 µg/ml	20 小时	诱导UPR		¹³
HEI-OC1	5, 50, 100 µg/ml	12, 24, 48 小时	剂量和时间依赖性细胞死亡		²³
多发性骨髓瘤细胞	100 µM	早期	早期XBP1剪接	(U266, H929, MM1s)	²⁰
Huh-7	5 µg/mL	未明确	未下调IRE1-XBP1s通路	有效抑制SARS-CoV-2进入，无细胞毒性；与THA作用不同	⁴

5. 硫普西加和衣霉素对K562 UPR影响的比较分析

5.1 UPR诱导动力学和幅度的异同

硫普西加（TG）和衣霉素（TM）都是强效的内质网应激诱导剂，均能导致XBP1剪接，尽管它们通过不同的机制发挥作用 ³。在K562细胞中，两者都在8小时内诱导了XBP1剪接 ⁹。在不同细胞系中，XBP1剪接的动力学对于这两种药物都显得相对迅速，通常在几分钟内即可检测到，并在数小时内（例如4-8小时）达到最大水平 ¹。

然而，反应的幅度和具体的下游效应可能有所不同。例如，在Huh-7细胞中，据报道THA下调了IRE1-XBP1s通路，而TUN则没有 ⁴。这一观察突出表明，UPR的诱导结果具有高度的背景依赖性。这意味着，即使是经典的UPR诱导剂，其在特定细胞环境（例如，存在病毒感染、特定的细胞系特性或其他并发刺激）中的作用也可能显著改变UPR的响应。因此，研究人员不应假设TG和TM会产生相同的UPR结果，尤其是在研究癌症或病毒感染等复杂生物系统时，应验证其所选模型中特定UPR通路的激活情况。

5.2 实验设计考量

鉴于高浓度或长时间暴露可能导致细胞毒性 ²³，研究人员应仔细滴定浓度和持续时间，以实现所需的UPR激活（例如，适应性UPR或促凋亡UPR），同时最大程度地减少不必要的细胞死亡。对于K562细胞，基于对其他人类细胞系和有限K562数据的推断，建议的起始范围是

500 nM至1 µM的硫普西加 和 4-5 µg/mL的衣霉素，暴露持续时间为 8-12小时。然而，强烈建议进行经验性优化。

数据中呈现的TG和TM在不同人类细胞系中有效浓度和持续时间的范围，以及在特定背景下（如Huh-7细胞）出现的变异甚至矛盾结果 ⁴，表明“一刀切”的方法是不足的。对于K562细胞，由于直接精确数据有限，研究人员必须进行细致的剂量-反应和时间进程实验。这种精确性至关重要，因为UPR是双相的（适应性与凋亡性） ⁴，并且实验目的（例如，研究适应性反应、诱导细胞死亡或探究药物协同作用）将决定最佳参数。因此，实验设计应是迭代的，从建议的范围开始，并进行微调以在K562细胞中实现所需的UPR状态。

6. 评估XBP1剪接的方法学考量

6.1 常用技术

评估XBP1剪接的方法选择对所获得数据的精确性和类型具有直接影响。

逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) / 定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR): 这是检测XBP1 mRNA剪接最常用的方法 ³。该方法依赖于26个核苷酸内含子的切除，导致XBP1s的扩增子比XBP1u小，可通过凝胶电泳检测 ³。使用特异性引物区分剪接和未剪接形式（例如，¹⁹中提及的XBP1spliceF/R引物）。qRT-PCR允许对sXBP1 mRNA水平进行定量测量 ¹³。
XBP1剪接报告基因细胞系: 这些工程化细胞系包含一个报告基因（例如，纳米荧光素酶），其表达依赖于IRE1介导的XBP1剪接 ⁷。这使得能够实时监测IRE1内切核酸酶活性，并识别调节内质网应激的分子 ⁷。此类报告系统提供了一种可靠且准确的方法来研究IRE1的调控以及识别内质网应激调节分子。
Western Blotting: 虽然不直接测量mRNA剪接，但Western blot可以检测XBP1s的蛋白质产物，由于移码，其分子量不同，或检测由XBP1s诱导的下游UPR靶基因（例如，BiP、CHOP）¹⁶。

方法选择影响数据的精确性和类型。RT-PCR是检测剪接事件本身的标准方法 ³，而qRT-PCR则量化剪接XBP1 mRNA的水平 ¹³。报告基因细胞系 ⁷ 提供高通量筛选和实时动力学，但依赖于外源构建体。Western blotting ¹⁶ 评估蛋白质产物和下游效应，这可能比mRNA剪接有延迟。某些RT-PCR方法的“半定量”性质 ²² 意味着精确的倍数变化最好通过qRT-PCR进行评估。因此，研究人员应根据其具体的实验问题（例如，定性检测与定量动力学）选择合适的方法，并了解其局限性以及它实际测量的是UPR激活的哪个方面。

7. 结论与未来研究方向

7.1 K562细胞UPR诱导的最佳条件总结

基于现有文献，尽管直接报告的用于K562细胞XBP1剪接的TG和TM精确浓度有限，但在用这两种药物处理K562细胞8小时后，观察到了强烈的UPR激活，包括XBP1剪接 ⁹。衣霉素也被证实能诱导K562细胞的剪接 ²²。

从其他人类细胞系推断，硫普西加的有效浓度范围为 500 nM至10 µM ³，其中500 nM在永生化B细胞中8小时内显示出XBP1剪接 ³。对于衣霉素，

4-5 µg/mL 的浓度在其他人类细胞系（永生化B细胞、Calu-3、HeLa）中持续 8-12小时 可有效诱导XBP1剪接 ³。因此，建议在K562细胞中诱导XBP1剪接的起始点为

500 nM至1 µM的硫普西加 和 4-5 µg/mL的衣霉素，暴露持续时间为 8-12小时。

7.2 对白血病研究和治疗策略的更广泛影响

UPR在白血病中扮演着复杂的角色，既是促生存机制，也是诱导细胞死亡的潜在靶点 ⁵。在K562细胞中精确控制UPR诱导（以XBP1剪接为指标）对于剖析这些双重作用以及开发针对髓系白血病的靶向治疗策略至关重要 ⁸。

尽管本报告汇编了现有数据，但K562细胞的精确最佳浓度和持续时间仍需进一步推断。这凸显了转化研究中的一个关键空白。鉴于UPR可以是促生存或促凋亡的 ⁵，并且特定细胞背景（例如K562的白血病起源）会影响UPR结果 ⁴，因此对K562细胞进行经验性优化不仅是良好实践，更是必要之举。这确保了所诱导的UPR状态与研究目标相符，无论是研究适应性机制、耐药性还是诱导细胞死亡以达到治疗目的。这强调了科学探究的迭代性质以及在特定模型系统中验证发现对于转化影响的重要性。未来的研究应侧重于通过详细的剂量-反应和时间进程研究，专门针对K562细胞优化这些条件，尤其要考虑TG和TM对UPR通路可能产生的差异性调节以及从适应性UPR向细胞凋亡的转变。

0.5 μg/mL TM处理K562 6h，2h完全Xbp1s，但6h又全部恢复Xbp1u了

Tg, Tm and H2O2 individually in 5 µg/l, 0.1 µM and 3 µM respectively. cells were subjected to treatments
for **8 hours**.

这里0.1 μM TM换算是0.84 μg/mL

Total period of exposure was **eight hours.** The utilized concentrations of H₂O₂, Tg, and Tm were 3 µM, 5 μg/L, and 1 µM, respectively.

上面两张图的文献都用了5μg/L 的 Thapsigargin，约等于0.0076μM；但是TM分别用了0.1μM和1μM

我要做个预实验摸索浓度和时间，先尝试：

TG组: 0.01, 0.1, 1 µM (处理 6小时)。
TM组: 0.01, 0.1, 1 μM (处理 6小时)。

K562细胞ER Stress诱导 (12孔板, 1mL体系)

一、准备

细胞: K562细胞，对数生长期。
母液: 1 mM TG (in DMSO), 1 mM TM (in DMSO)。
耗材: 12孔板。

二、步骤

铺板:
- 每孔铺 0.5 x 10⁶ 个细胞，用培养基补足至 1 mL。
药物稀释 (用DMSO):
- 100 µM工作液: 取 2 µL 的1 mM母液 + 18 µL DMSO。
- 10 µM工作液: 取 2 µL 的100 µM工作液 + 18 µL DMSO。
加药 (每孔加入 1 µL):

组别	目标终浓度	加入液体 (1 µL)
1. 对照	0 (DMSO)	DMSO
2. TG-低	0.01 µM	10 µM TG
3. TG-中	0.1 µM	100 µM TG
4. TG-高	1 µM	1 mM TG
5. TM-低	0.01 µM	10 µM TM
6. TM-中	0.1 µM	100 µM TM
7. TM-高	1 µM	1 mM TM

培养:
- 混匀，放入培养箱孵育 6 小时。
收获:
- 吹打细胞，离心，PBS洗涤，提取RNA或蛋白。