两年前的一次组会上文献分享，我介绍了processed pseudogenes的概念，最近从genome中PCR某个片段，最后质粒测序出现非常多的碱基突变。一种可能是，我所用细胞的genome序列就是这样，跟数据库参考序列不一致；另一种可能（恰恰是本次遇到的），基因组中存在序列几乎完全相同的基因拷贝，被我的PCR引物同时命中了。
调查方法是直接把我质粒测序结果做了了nucleotide blast，然后发现确实如此，我要PCR的基因是SLC7A5，但我实际扩增到的是SLC7A5P1, 同时还有一个序列也极其相似的SLC7A5P2.
这个故事告诉我们，但凡从genome或cDNA pool等复杂模板PCR，都应当在引物设计阶段用primer blast检查特异性（或者直接用Primer blast生成特异性引物）。
其实我这次P到假基因还有一个原因是我为了提高成功概率用了多对引物multiplex PCR，将multiplex PCR产物再继续作为模板做下一步nested PCR。在multiplex PCR阶段，我用的Primer-F1&R1, F2&R2其实特异性都还可以，但问题我全放在一个反应体系了，结果F1和R2, F2和R1会扩到假基因……所以如果真的要multiplex PCR的话，应该把所有引物对的排列组合都做primer-blast.