By ChatGPT GPT-5 Deep Research
2025.10.12
引言
Thymidylate synthase（TYMS，又称TS）基因编码嘧啶核苷酸合成所需的胸苷酸合酶，是细胞DNA合成的关键酶[1]。由于TYMS在细胞增殖中的重要作用，它也是5-氟尿嘧啶（5-FU）等抗代谢化疗药物的主要靶点[2]。近年的研究发现，邻近TYMS基因存在一个特殊的基因ENOSF1（Enolase Superfamily Member 1），该基因能够以天然反义RNA的形式调控TYMS的表达，被称为“反向胸苷酸合酶”（reverse TS, rTS）[3][4]。本报告将围绕ENOSF1与TYMS之间的关系展开调查，包括两者的基因位置关系、ENOSF1对TYMS表达的调控机制，以及在分子检测（如RT-qPCR）中ENOSF1对TYMS检测的潜在干扰，并结合文献讨论引物设计的注意事项。
基因定位与反义配对关系
染色体位置与重叠关系： TYMS和ENOSF1基因位于人类18号染色体p11.32区域，基因位置毗邻且部分序列重叠[4][5]。具体而言，TYMS基因定位于18p11.32，大约位于染色体坐标chr18: 657653–673578（GRCh38），包含8个外显子[6]。ENOSF1基因同样位于18p11.32，其基因组范围约为chr18: 662986–712630（反义链）[7]。由于ENOSF1在染色体上与TYMS存在区段重叠且转录方向相反，两者形成天然反义基因对[4]。换句话说，ENOSF1基因的部分转录产物与TYMS基因的末端外显子/UTR区域互补配对，从基因组布局上看属于反义重叠基因[4]。文献报道指出：“ENOSF1和TYMS基因在18号染色体上部分重叠，且转录方向相反”[5]。这种反义基因配对关系意味着ENOSF1有产生与TYMS mRNA互补的RNA片段的可能。
反义RNA与别名： ENOSF1基因最初就是通过其天然反义转录本被发现的。早在1993年，Dolnick等人克隆并鉴定了一个天然存在的针对人TYMS mRNA的反义RNA[8]。因此ENOSF1有时被称作TYMS反义RNA基因（TYMS antisense, 缩写TYMSAS）或反向TS（rTS）基因[3]。ENOSF1基因本身可以编码蛋白质，但由于其反义RNA特性，曾被视为“反义的TS”而受到关注[3]。
基因结构及转录变体： ENOSF1基因相当复杂，已有研究指出其存在多个转录异构体（文献报道3种主要的ENOSF1剪接异构体）[9][10]。其中一个变体编码长约443个氨基酸的蛋白质，被鉴定为线粒体L-岩藻糖酸脱水酶（L-fuconate dehydratase），即ENOSF1的酶活性形式[3][10]。有趣的是，另一些转录变体包含了与TYMS基因3’端重叠的片段，即这些ENOSF1转录本带有互补于TYMS 3’UTR及末端内含子的序列[11]。RefSeq的注释指出：“该基因座的剪接变体可能包含一个可变的3’末端外显子，与胸苷酸合酶(TS)转录本的3’UTR和末端内含子互补，并可能下调TS的表达”[11]。由此可见，并非所有ENOSF1转录本都参与反义调控，但特定的变体（通常称为rTS-α/β等）承担了反义作用[3]。这种基因结构意味着ENOSF1在基因组上与TYMS呈尾对尾（tail-to-tail）重叠布局（即TYMS的3’末端区域与ENOSF1的某一末端外显子重叠反义），为后续的转录调控提供了物质基础。
下表对两者的基因定位和关系进行简要总结：
| 基因 | 染色体位置 (GRCh38) | 转录方向 | 与对方基因的关系 |
| TYMS | Chr18: 657653–673578 | 正义链 | 与ENOSF1部分重叠（3’端）[4]；被ENOSF1反义RNA互补调控 |
| ENOSF1 | Chr18: 662986–712630（-*） | 反义链 | 与TYMS部分重叠（包含互补于TYMS 3’UTR的外显子）[11]；产生TYMS反义RNA |
注：ENOSF1位置坐标为反义链上的区段，其转录方向与TYMS相反。
ENOSF1对TYMS表达的调控作用
反义转录本调控： ENOSF1通过其天然反义RNA对TYMS表达施加调控作用。大量证据表明，ENOSF1产生的反义RNA能够与TYMS的mRNA形成互补配对，从而影响TYMS mRNA的稳定性和翻译效率[12][13]。例如，有研究指出：“TYMS的表达受其反义mRNA（ENOSF1）的调控”[14]；ENOSF1基因编码一种反义转录本，可下调TYMS基因的表达[13]。这种反义作用具体机制可能包括RNA-RNA双链的形成导致mRNA降解（类似RNA干扰或引发剪切）[15]、或者阻滞翻译过程等。
实验观察和功能证据： 在细胞水平上，ENOSF1与TYMS表达呈明显的负相关关系。当细胞增殖由对数增长后期进入平台期时，TYMS基因的表达下降，而ENOSF1（反义转录）的表达上调，二者此消彼长[16]。RefSeq注释指出：“当细胞生长由对数后期进展到平台期时，TYMS基因及其天然反义转录本ENOSF1的表达呈反向变化”[16]。同样地，在肿瘤组织中也观察到类似现象：高表达TYMS的样本往往ENOSF1表达低下，反之亦然[17]。例如，一项胃癌研究报告：“在肿瘤组织中TYMS和ENOSF1的表达呈显著负相关（p = 0.001），TYMS过表达的样本中ENOSF1表达降低”[17]。这些现象与ENOSF1反义抑制TYMS的功能相吻合。
更直接的功能研究也支持ENOSF1对TYMS的抑制作用：过表达ENOSF1会降低TYMS的mRNA和蛋白水平，而沉默ENOSF1可解除对TYMS的抑制。如Tummala等人的细胞实验显示，利用siRNA敲低ENOSF1能够“显著恢复内源性TYMS的mRNA和蛋白水平”[18]。相应地，过量表达外源TYMS可以竞争性削弱ENOSF1反义RNA的作用，从而提高TYMS蛋白含量[19]。此外，生物信息学分析定位了TYMS与ENOSF1 RNA之间的精确互补区域：TYMS转录本第564–713位核苷酸区域与ENOSF1转录本第4834–4983位核苷酸区域可以形成稳定的碱基配对[20]。这一互补区位于TYMS的3’UTR附近，与ENOSF1的可变末端外显子相对应[21]。这种高度互补的序列为ENOSF1反义RNA直接结合并后转录水平抑制TYMS提供了基础[21][12]。
调控作用总结： 综合来看，ENOSF1通过产生自然反义RNA直接与TYMS mRNA互补结合，从而抑制TYMS的表达[12]。这可能通过促进TYMS mRNA降解或阻碍其翻译实现[15]。另外，ENOSF1编码的蛋白（如rTSβ变体）可能在蛋白质水平调节TYMS的活性[22][23]。文献指出ENOSF1具有“双重作用”，既编码代谢酶，又以反义转录本调控TS的mRNA和蛋白水平[22][24]。尽管ENOSF1在5-FU代谢途径中并无直接酶作用[10]，但它作为TYMS的反义调节因子在肿瘤化疗反应及毒性中具有重要影响[24]。因此，在涉及TYMS功能或表达的研究中，应充分考虑ENOSF1反义调控这一层面。
RT-qPCR检测中的干扰可能性
序列相似性与cDNA扩增： 由于ENOSF1和TYMS之间存在反义重叠，其序列互补关系可能对常规的mRNA检测实验（如RT-qPCR）造成干扰。在RT-qPCR中，实验步骤通常包括用随机引物或oligo(dT)对总RNA进行逆转录，生成cDNA，然后使用基因特异性引物扩增目的cDNA片段。如果ENOSF1存在反义转录本与TYMS mRNA部分重叠，那么ENOSF1的该段RNA在逆转录后会生成与TYMS相同序列的cDNA片段（因为反义RNA的cDNA即为互补链的互补，等同于原始正义链序列）。具体而言，ENOSF1某些剪接变体的3’末端互补于TYMS转录本的3’UTR和末端内含子[11]。这些ENOSF1来源的cDNA片段在序列上与TYMS的3’UTR区域高度相似甚至相同。因此，如果qPCR的引物或探针设计靶向了TYMS的3’UTR或重叠区，就有可能同时扩增来自ENOSF1反义转录的cDNA，造成对TYMS表达定量的高估或混淆。
实验共转录干扰： 除了序列同源性外，ENOSF1与TYMS的反义RNA还可能在细胞中形成双链RNA或RNA复合物。这在分子检测中也需注意。例如，在非链特异性的RNA定量方法（常规qPCR、cDNA微阵列检测等）中，探针无法区分信号来自正义链mRNA还是反义链RNA。如果ENOSF1反义RNA与TYMS mRNA形成杂交双链，可能影响两者的提取效率或稳定性。此外，以cDNA为模板的PCR本身不区分来源链，只要有互补模板就能扩增，因而反义转录本可能充当“模板”干扰TYMS的信号。
文献线索： 文献中已有对这种干扰可能性的提示。NCBI基因数据库指出ENOSF1的某些转录变体携带与TS转录本互补的序列，可以下调TS表达[11]。这暗示在检测TS mRNA时，ENOSF1的存在会影响检测结果的特异性。尽管我们未找到直接报道“引物非特异性导致TYMS信号实为ENOSF1”的具体案例，但鉴于ENOSF1反义RNA的发现史，可以推测过去一些对TYMS转录水平的研究中，未意识到ENOSF1存在时可能出现了数据解释偏差。Dolnick等人在1990年代初发现反义TS RNA，即是通过检测意外的转录产物而揭示ENOSF1的存在[8]。此后，一些药理遗传学研究将TYMS和ENOSF1视作一个功能单元来考察，发现TYMS基因下游/3’侧的多态性实际上位于ENOSF1内，影响两者表达调控和药物反应[25][20]。例如，有SNP同时位于TYMS的3’非编码区和ENOSF1的内含子，被证明与化疗毒性相关[25]。这些线索都说明，在TYMS表达分析中忽视ENOSF1可能导致误差。
引物/探针设计的影响： 若TYMS的qPCR引物设计不佳，正好位于ENOSF1反义重叠区域，则扩增可能并非纯粹来自TYMS mRNA。例如，若上游引物靶向TYMS 3’UTR的一段序列，而该序列正是ENOSF1反义外显子的互补序列，那么来自ENOSF1的cDNA将作为模板被扩增，导致所得CT值降低、表达量虚高。为验证这一点，研究者可采用链特异性检测（如设计引物只扩增特定链的RNA，或使用引物跨越外显子连接处以避免扩增基因组片段及未剪接的反义RNA）。在已有的研究中，一些作者已经意识到需要分别测定TYMS和ENOSF1的转录水平。例如，Arjmandi等人在分析胃癌组织时，为TYMS和ENOSF1分别设计了特异引物进行qPCR，以避免互相干扰[26][27]。他们在讨论中也强调了ENOSF1作为重叠基因可能对TYMS功能产生的影响[28][29]。因此，规范的做法是区分检测：分别选取不重叠的序列区域设计TYMS引物，以及ENOSF1引物，从而排除交叉扩增的可能。
文献案例与引物设计注意事项
文献报道的实例： 虽然直接因引物靶向错误而误测TYMS的公开报道较少，但文献中多次提示要考虑ENOSF1的影响。Dolnick等人的系列研究在克隆反义TS RNA时，就提醒科研人员存在一个“隐藏”的反义基因可能影响TS表达测定[8]。此后，针对5-FU化疗毒性的药物基因组研究中，反复出现TYMS与ENOSF1连锁多态性共同影响表型的报道。例如，有研究发现ENOSF1基因内的SNP（如rs2612091）与患者对卡培他滨/5-FU治疗的毒副反应相关，其作用被认为是通过调节ENOSF1反义RNA进而影响TYMS表达[30][31]。在这些研究中，如果不区分两基因的表达，很可能误将ENOSF1的作用归因于TYMS。例如，某些早期的表达定量实验和芯片分析未采用链特异探针，理论上ENOSF1反义转录本可以与针对TYMS的探针杂交，导致TYMS表达量被高估。针对这一点，Johnson等在1994年的综述中就指出，需要在转录后水平考察TS表达调控时考虑反义RNA的贡献[32]。
引物设计与对策： 为避免ENOSF1对TYMS检测的干扰，建议采取如下措施：
- 选择独特序列区域： 尽量将TYMS引物设计在不与ENOSF1重叠的区域，例如TYMS的编码序列中部或5’端外显子区域。避免使用TYMS的3’UTR序列作为qPCR扩增区段，因为ENOSF1反义片段主要针对TYMS的3’端[11]。如果必须检测TYMS 3’端的表达，需确认该区域序列在ENOSF1转录本中不存在互补片段。
- 跨外显子引物： 设计跨越外显子–外显子接头的引物，使其只扩增成熟mRNA。这不仅防止基因组DNA污染扩增，也使得若ENOSF1的反义片段包含TYMS的内含子序列，因剪接差异将无法高效扩增。例如，TYMS最后一个外显子与倒数第二个外显子连接处的引物，可避免扩增含末端内含子的ENOSF1反义cDNA。
- 链特异性RT或探针： 采用链特异性反转录（使用针对目标mRNA的特异引物进行cDNA合成）或链特异探针（如使用LNA探针区分反义链），以确保仅检测TYMS正义链转录。本质上，区分信号来源是关键，必要时可以设计同时检测ENOSF1的qPCR作为对照，如果发现所谓“TYMS”信号与ENOSF1高度相关，提示引物可能有非特异扩增。
- 验证引物特异性： 通过体外实验验证引物不会扩增ENOSF1模板。例如，用ENOSF1的cDNA克隆或反义RNA合成物作为PCR模板，验证TYMS引物是否产生扩增信号。如有信号则需重新设计引物。亦可利用生物信息学比对分析引物序列，确保其仅比对TYMS转录本而不匹配ENOSF1反义序列（或者至少ΔTm较大）。
重设计引物的必要性评估： 用户需要根据自身实验中所用TYMS引物/探针的序列，检查其是否位于TYMS与ENOSF1的重叠区。如果是，则非常有必要重新设计。例如，若现有引物在TYMS的3’UTR，且ENOSF1有互补序列，那么定量结果可能包含反义转录本的贡献。重新设计至非重叠区将提高特异性和准确性。若目前引物远离重叠区（例如在TYMS 5’UTR或前部编码区），干扰可能性较低，但依然需警惕共转录本的影响（如是否有TYMS反义链RNA未被完全去除）。另外，可以在实验中增加适当的对照：比如检测ENOSF1的表达，或利用敲低ENOSF1的方法观察TYMS信号有无变化[18], 以评估干扰程度。
结论
ENOSF1与TYMS构成了一个特殊的基因对：它们在基因组上相邻并部分反义重叠，ENOSF1通过天然反义RNA等机制负向调控TYMS的表达[13][17]。这一关系在细胞增殖调控和抗癌药物响应中具有重要生物学和临床意义[16][25]。对于科研和检测而言，这种反义重叠意味着常规的mRNA定量实验可能受到干扰。特别是在RT-qPCR或Northern blot等检测中，若引物/探针设计不当，ENOSF1的转录本信号会混杂于TYMS信号中，影响定量解读。为了获得准确可靠的TYMS表达数据，应根据文献证据和生物信息分析优化引物设计，避开重叠区并必要时采用链特异策略。综上，用户在分析TYMS基因表达时需要考虑ENOSF1的干扰潜力，合理设计实验以控制和排除ENOSF1的影响，从而确保结果反映真实的TYMS表达水平。
参考文献：
- NCBI基因数据库 – ENOSF1基因简介[11]
- NCBI基因数据库 – TYMS基因简介[16]
- Arjmandi K et al. J Pathol Transl Med. (2024) – 探讨胃癌中TYMS和ENOSF1表达及多态性[22][17]
- Tummala H et al. Cell Reports. (2022) – TYMS缺陷和ENOSF1反义作用的功能研究[12][18]
- Hamzic S et al. Pharmacol Res. (2019) – 荟萃分析ENOSF1/TYMS多态性与化疗毒性[4][24]
- Palles C et al. Gut. (2015) – 报道ENOSF1与TYMS重叠转录及药物毒性关联[25]
- Wu Q & Dolnick BJ. Nucleic Acids Res. (1993) – 首次克隆鉴定TYMS天然反义RNA（TYMSAS）[8]
[1] [2] [6] TYMS thymidylate synthetase [Homo sapiens (human)] – Gene – NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=7298
[3] [8] [9] [15] [32] sc-77275
https://datasheets.scbt.com/sc-77275.pdf
[4] [5] [10] [24] (PDF) Evaluating the role of ENOSF1 and TYMS variants as predictors in fluoropyrimidine-related toxicities: An IPD meta-analysis
[7] [11] ENOSF1 enolase superfamily member 1 [Homo sapiens (human)] – Gene – NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55556
[12] [18] [19] [20] [21] [25] Germline thymidylate synthase deficiency impacts nucleotide metabolism and causes dyskeratosis congenita – PMC
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9388389
[13] [14] rs495139 in the TYMS-ENOSF1 Region and Risk of Ovarian Carcinoma of Mucinous Histology
https://www.mdpi.com/1422-0067/19/9/2473
[16] TYMS thymidylate synthetase [Homo sapiens (human)] – Gene – NCBI
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7298
[17] [22] [23] [26] [27] [28] [29] [30] [31] Association study of TYMS gene expression with TYMS and ENOSF1 genetic variants in neoadjuvant chemotherapy response of gastric cancer