SRP9/14 dTAG单克隆鉴定

SRP9的加dTAG 6h， SRP14的加dTAG 2h

分别用anti-SRP9/anti-SRP14和anti-HA做WB，加1/4 WT NCCIT对照。

2024.3.19 0:26刚传代，每个单克隆传到2个12-well plate孔。之后的不加药组传代时分一半继续传代保种。

加药（稀释5000倍），只加500μL培养基（对于短时间<6h）。时间到了，消化细胞。

收集完细胞，1M细胞用30~50μL WB lysis buffer，加1/100的cocktail和PMSF。4℃转半小时。离心14000rpm,4℃,10min。先测浓度。

900μL BradFord + 3μL样品（相当于稀释十倍，浓度结果×10）

加5分之1的6x SDS loading buffer，95℃煮5min，冷却。

统一细胞数量。上样30μg每个孔蛋白。15-well gel.（左右对称上样）

上样顺序：M, WT, 0h, xh, 0h, xh, 0h, xh, 1/40h, M （上Marker 5μL ,货号26616，不带PLUS的那个）

同样的样品上两块胶。

要用0.2μL的膜转膜。（SRP9只有9KD，14是14KD）找一个最短的转膜时间的程序（Method 1，长按setting调程序）。

抗体SRP14 1:1000, SRP9 1:2000（可以用张咏妍的，已经放到我的-20了）

2024.3.10 23:14张咏妍说她帮我再铺一次板。我明天下午从圆明园回来后加药、做WT。

2024.3.11下午张咏妍重新铺了板。

2024.3.12 24:00 给SRP9的加dTAG（其他孔换液），打算处理10h。早上8点给SRP14加dTAG，处理2h。这样10点可以统一收细胞。

WB实验结果表明没有加上dTAG，原因是从冰箱里拿错药了。所以又重新做了，这次SRP9加药处理了10.5h，SRP14 2h.

第一块胶（4~20% 12孔）：Marker, WT, 44, 44+, 51, 51+,54,54+,55,55+,四分之一44(0.85ul),Marker

第二块胶（4~20% 12孔）：Marker, WT, 44, 44+, 51, 51+,54,54+,55,55+,四分之一44(0.85ul),Marker

第三块胶（4~20% 15孔）：Marker, WT, 9, 9+, 16, 16+, 四分之一16 (0.9), Marker, APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2, Marker

第四块胶（4~20% 15孔）：Marker, WT, 9, 9+, 16, 16+, 四分之一16 (0.9), Marker, APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2, Marker

抗体分别为HA rabbit, SRP14 rabbit, HA rabbit, SRP9 rabbit (不含V5的那3个样品)

封闭有点问题，用的PBST没加Tween-20，而且因为懒的起床，直接室温封闭了十几个小时。

一抗室温1h。