基于CRISPR/Cas9和Cre-LoxP的成年小鼠基因敲除

对小鼠进行基因敲除是研究目的基因功能的常用方法。传统的、从受精卵或胚胎时期进行基因操作，来获得基因敲除小鼠的方法往往耗时长达几年。AAV（腺相关病毒）递送系统结合CRISPR/Cas9可以实现对成年小鼠的基因敲除，从而大大缩短获得基因敲除小鼠的时间。AAV还具有低免疫原性、不同血清型实现靶向不同组织或器官的优点。

与此同时，AAV递送系统有一个固有缺陷，其载体所能容纳的插入序列最大只有4.7Kb。使用CRISPR/Cas9进行基因敲除，需要将含有Cas9编码序列和sgRNA的载体进行递送。然而，Streptococcus pyogenes (SpCas9) 和 gRNA together就占了4.2kb，对AAV的容量产生了挑战。因此，如何对Cas9进行有效的递送一直是CRISPR/Cas9在动物体内发挥作用的难点。过去的方法包括：在不同物种中寻找序列更短更有效的Cas9、将Cas9分段表达在两个AAV载体等。

北大王晓伟课题组于2021年9月在STAR Protocols杂志发表了一篇文章记录一种结合了Cre-LoxP和CRISPR/Cas9、用AAV递送，实现对成年小鼠进行组织特异性基因敲除的方法。

原理大致为：

将panel A所示的片段整合入野生小鼠，panel B所示片段用AAV递送。对于不同的靶基因来说，左边的小鼠都是用的同一种，但是B中的序列可以根据需要自定义。以图示为例，TBG是肝脏特异性启动子，AAV感染小鼠后，Cre酶只在肝脏中表达，在小鼠的肝脏中删去两个loxp包裹的stop signal，spCas9得以表达，与Cre一同转导入动物的还有sgRNA，于是实现在肝脏中对该sgRNA靶向的片段进行切割。spCas9后面还接了GFP方便实验者观察Cre酶是否成功发挥作用。

该方法的优点有：

1. 把Cas9从载体上拯救下来，相当于给AAV扩容了，可以加更长的组织特异启动子或其他有特殊目的的元件。
2. GFP对Cre酶的活性进行了可视化。
3. 有个这样的小鼠也许会更方便吧。（比如相比于传统方法不用为每个基因单独构建flox小鼠了，当然因为没有同源重组过程，用途也局限了）

原文链接：

Wang X, Xu BL, Chen XW. Acute gene inactivation in the adult mouse liver using the CRISPR-Cas9 technology. STAR Protoc. 2021 Jun 17;2(3):100611. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100611. PMID: 34189476; PMCID: PMC8220398.

参考博文：

鸣谢：小龙哥