核对一批 CRISPR KO 的 RNA-seq 时，我发现两条 sgRNA 里有一条的编辑率是 0%。这很容易被解释成“这条 guide 没切动”，但把同一套脚本搬到姊妹项目上，整个基因跑出 0 个候选切点——干净得不正常。继续追查后才发现：0% 不是实验失败，是扫描脚本制造的假象。
先说为什么要费这个劲。CRISPR indel 不一定触发 NMD，所以靶基因的 TPM 没降，既不能证明没敲掉，也不能证明敲掉了。想知道敲没敲成，只能回到 BAM 里，逐条数跨过切点的 read。
问题出在哪
HISAT2 把超过约 20 bp 的缺失当成内含子，在 CIGAR 里记成 N 而不是 D。而写 CIGAR 遍历时，几乎所有人都会顺手把 N 当剪接跳过：
for op, ln in read.cigartuples:
if op == 0: pos += ln # M
elif op == 2: mark_deletion() # D，小 indel 抓到了
elif op == 3: pos += ln # N，大缺失全从这里漏光因果链很短：大缺失被记成 N → 遍历时当剪接跳过 → 这条 read 不计入病变 → 编辑率接近零。
那条报 0% 的 guide，真实情况是它的编辑几乎全是大缺失。姊妹项目那两条 guide 也一样，主等位分别是 27、22、54、357 bp 的缺失，一条都不在 D 里。
有多大影响
同一批 BAM、同一个位点，只改遍历 CIGAR 的那一行，sgRNA 2 的编辑率从 0% 变成 85.7%，sgRNA 1 从 10.8% 变成 32.0%。四个切点全部中招，低估了 4 到 14 倍。
代价也要说清楚：把非注释的 N 计入之后，非靶样本的本底从精确 0 升到 ≤6%，原先“非目标样本必须为零”的判据得相应放宽。这笔交易是划算的——漏掉全部大等位是致命的，本底 6% 只是让判据不那么漂亮。
怎么修
病变的定义改成 D、I、以及供体或受体不落在注释剪接位点上的 N。从 GTF 里把该基因所有转录本的内含子首末碱基取出来做白名单，白名单之外的 N 一律按缺失算。
顺带还有几个地方会翻车
修完 N 之后，我又在另外几处栽了跟头，一并记下来。
分母不能用覆盖度。 缺失掉的碱基本身不被 M 覆盖，一条带缺失的 read 会进分子却不进分母，于是算出大于 100% 的编辑率。分母应该是跨越该位点的全部 read，带病变的和不带的都算。
判据要看特异性，不看幅度。 剪接边界会在所有样本里都产生 indel 假象，我们有个位点在 12 管里都是 40–80%，看着惊人，跟 CRISPR 无关。真切点的特征是非靶样本干净，而它自己的编辑率可以很低——有条真实切点逐位点只有 3–4%，被“编辑率 > 8%”的阈值直接漏掉了。反过来，“要求两组独立细胞都命中同一位点”是很强的特异性约束，但它会漏掉只在单组成功的编辑：上面那条 86% 的 guide 只在一个臂里命中，另一个臂 0/35 条，那是 read 太少功效不足，不是没编辑。所以拿到 guide 序列后，应当直接查预期切点，别只靠复现判据。
“编辑率”一个数说不清。 切割还会诱发外显子跳读——Cas9 切开后，剪接机器把含切点的整个外显子跳过去，接的是两个已注释的剪接位点。注释白名单会放行它，因为它看起来就是一次正常剪接，但它只在对应 guide 的样本里出现。把跳读并进编辑率，数字从 20% 涨到 50%，可那两条跳读全是整码的（少 88 aa 和 128 aa），移码率一点没动。所以后来不再输出一个数，而是把每条 read 归到“病变类型 × 是否移码”里，分开报编辑率（切到了没有）和移码率（蛋白可能坏了没有）。两条 guide 的编辑率是 32.0% 和 85.7%，移码率却只有 9.2% 和 14.3%。
阅读框要按 CDS 算。 拿病变在基因组上的跨度去 % 3 是错的，跨度里含内含子。一段 1011 bp 的基因组跳读，落到 CDS 上只去掉 264 bp，也就是 88 个氨基酸，不是 337 个。应该取 MANE Select 转录本的 CDS 区段，只累加病变与 CDS 的交集长度。
整码不等于敲掉，也不等于没敲掉
拿到干净的数之后还有一步判读。某条 guide 编辑率 32–50%、移码率只有 9–12%，其余是整码 indel 和整码跳读，这该怎么说？
不能说“没敲掉”——少掉 88 个氨基酸是全长的 10.7%，多结构域蛋白的内部缺失完全可能失活。但也不能说“敲掉了”——整码意味着蛋白仍然被翻译出来。
这一条直接决定验证实验怎么读：整码截短等位在 western 上预期是一条位移的带，不是消失的带。只按“有没有带”读胶，会把这条 guide 误判成完全没敲掉。
顺带也解开了一个假矛盾。“靶基因 mRNA 没降，所以没敲掉”是错误推理：大缺失和外显子跳读不产生近端提前终止密码子，转录本本来就不该被 NMD 清掉，mRNA 稳定和编辑率很高可以同时成立。
RNA-seq 到哪儿为止
它能告诉你切点在哪、等位怎么构成、每类等位整码还是移码，而且不用额外做实验。但它答不了蛋白到底还在不在——那只有 western 能答；它给的等位频率也偏低，因为 NMD 会清掉一部分移码转录本；内含子和 UTR 里的编辑它更是看不见。完整的链条是 RNA-seq 定位分型 → gDNA amplicon 或 TIDE 核对频率 → western 确认蛋白。
一个简单的检查习惯
当一条 guide 报出 0%、或者一个基因干净得不像话时，先别急着说实验失败。去看一眼那些 read 到底去哪了——是真的没有病变，还是病变被记成了另一种 CIGAR 操作。在这类分析里，把口径写清楚通常比多算一个统计量更值钱。
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