可重复性问题

永远不要相信单次WB的实验结果，也不要对着结果过度分析，在重复三次以上之前。这次正好有个WT和KO样品搞反了的事故，所以用完全一样的样品又跑了一次，结果把两次的结果放在一起对比，发现对照之间的不少条带相对亮度在两次实验中是完全相反的，即下图中框框框起来的部分。

信号整体偏弱时的结果不可信

之前我用过的内参有beta-actin和beta-tubulin，这次打卡了HSP90。

我这个月第一次跑的时候，遇到了actin不齐的问题，蛋白样品已经用BCA法定量过了。但是遇到了同一拨样品、相同的上样量的三次平行重复中actin条带的相对亮度均不一致的问题。后来换了一个别的牌子的抗体，就每次都天然内参一致了。可能是第一次用的那个抗体要么回收次数过多、要么本身就不行。浪费了我整整三次完整的WB耗费的时间。

之后的WB我都直接用两个内参去跑了，同时孵anti-actin和anti-HSP90。回头想想，对于actin这种商业化抗体，且蛋白本身表达量高，应该1s就能曝出很亮的条带才对，当我第一次WB显影时发现曝光30s以上才出现那样微弱的条带时，就应该立刻意识到抗体出问题了，而不是用这个根本不可信的数据去无意义地调整上样量。

另外，我倾向于认为，当WB信号整体非常低时，比较两个泳道的相对条带亮度差异是极其不准确的，如第一张图中Protein A被框起来的条带，在两次重复实验中的相对亮度完全相反。

抗体选择问题

抗体不好不要找自己的问题，上面那个actin是一个例子，对于不常用蛋白，抗体本身就不行的可能很大。比如Protein I有IS和IU两种形式，用抗体一就只能得到IU形式，得不到IS形式，而用抗体二可以得到IS形式，可是IU条带就要弱得多。关键是，这两家抗体的说明书都写了能砸到两种形式的条带。

显色液问题

我有次曝出来这样一张图，最初是以为没有洗干净。比如洗膜时TBST加的太少，所以膜中间部分洗得不充分，导致中间比较脏而两侧干净。后来我发现其实只是我的显色液覆盖的不够均匀。这个小细节太重要了，它可能直接影响不同泳道之间的条带亮度差异。以后加显色液时，一定要左右晃动或用平板压片等方法把显色液加均匀。

曝光时间长短问题

你看这个HSP90，光看曝光1s，3s，10s的图，一看就内参不齐，要重新做。但是再一看曝光30s的，好像也不是那么不齐……你说这算不算造假呢？

抗体剥离问题

之前没尝试过这种方法。我用的碧云天的一抗二抗剥离液，效果不是很高，剥离完后显影条带确实弱了很多，但整张膜曝光出来都是黑色了。所以这个方法挺多自己排除错误等用途的时候自己看一看，不可能生产正式展示的图片，因为它剥离不干净的。

比如这张膜剥离后，用相同二抗重新孵育完又把原来的条带显示出来了。

​上面被剪掉一半的是二次孵育的抗体，下面的清晰条带是剥离过的抗体，因为所使用的二抗相同所以又显示出来了

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见过肖老师实验室一个师兄用过另一个牌子的抗体剥离液，他说原理是还原性成分。我看他剥离完之后那个膜在自然光下都成半透明的了。不过显影后确实很干净，什么条带都没有。可惜我忘记问是哪个公司的了。以及二次孵育抗体时，可以尽量选用不同二抗，来防止剥离过的抗体再现。

杂带影响主带时切膜

众所周知WB的预测大小和实际观察到的大小是有差异的，甚至可能差异很大。

我用anti-PDI（UPR途径中的蛋白）抗体一直以为它的实际大小小于预计大小，直到有一次二抗孵育了特别久，在这条带的上方出现了一条微弱的条带，而这条带的大小跟预计大小更接近。所以究竟哪一条才是PDI蛋白的条带呢？

也许只有Knockout大法才能真正不留悬念的解决这个问题，虽然这太麻烦了。

想要得到较亮的条带的话，需要把发光太强的干扰条带给切掉，不然曝光很久可能都爆不出来。

考马斯亮蓝染色

碧云天有个考马斯亮蓝染色液，非常好用快速。一个小时内可以看到清晰的条带。直接用水脱色。

配胶问题

4%~12%梯度预制胶YYDS，用配套的Running buffer可以恒压170V半个小时跑到底，而且条带清晰。梳子孔很深，据说可以每孔放40微升样品。美中不足是第一条和最后一条泳道略微有丢丢慢，所以跑成一个微弱的笑脸（我用的1.0mm 12孔胶）。

转膜问题

湿转的时候一定是“冰水浴”而不是“冰浴”，后者的冷却效果远远小于前者。所以加完冰之后继续加水到接近槽子顶部的位置。

有人会重复使用转膜液，在相同恒流下，新鲜的转膜液的电压会更高，转膜速度也会更快。

转膜时间不要太长（尤其在高电流的情况下），我先试了用恒流300mA转2h20min，冰浴，结果转完温度挺高的，而且膜严重脱水，出现了很多较大的气泡，转膜结果可想而知，Marker都哭歪了。后来，试了用恒流250mA转1h30min，冰水浴，转完效果就很好，膜还是湿湿的bia在滤纸上的状态。

样本处理问题

丽姐有次告诉我膜蛋白不能煮，煮了会聚团。不过我问其他做膜蛋白的人也没有说不能煮。

处理时间长短问题

如第一张图所示，之前超过24h的衣霉素处理在WT和KO之间一点差异都看不到。然后重新翻看文献的时间，设置了3h和16h处理组，结果16h没啥差异，3h有差异。算是切身体会到时间参数的重要性，以后要引以为戒。首先参考文献，如果文献查不到，自己也要设置覆盖度大一点的time-couse，比如x秒、x分、1h、3h、12h、24h等。这次就很险，如果没有重新做3h的组，可能就直接相信这个实验中没有差异了，导致错过了重要的现象。

细胞和组织样本差异问题

• 用衣霉素处理小鼠，取肝组织提蛋白
• 从小鼠肝脏分离肝原代细胞，衣霉素处理肝原代细胞，提蛋白
• 用肝脏来源细胞系，衣霉素处理，提蛋白

这三个结果可以天差地别。