关于给蛋白加tag

Q. 如何判断加了tag之后,自己的目的蛋白的折叠是否受到了影响呢?

  1. HA-tag是常见tag里面最小的,对目的蛋白的折叠产生负面影响的概率最小,可以优先考虑。
  2. 用anti-tag的抗体和anti-target protein的抗体同时进行免疫荧光,如果都正常发光并且共定位了,一定程度上可以说明目的蛋白正常表达且没有影响折叠。(做Western blot只能证明表达了,不能反映折叠正确与否,但是因为免疫荧光的抗原抗体反应是天然构象,因此可以作为折叠不错的证据。当然,仍然是必要不充分条件)
  3. 从功能上进行回补实验应该是最可靠的方法,虽然这非常麻烦。将目的蛋白敲除后,观察出现何种表型,在mutant中回补加了tag的原蛋白,看是否能够在功能上回补。如果可以,说明这个蛋白加了tag之后的功能依然正常。

构建完加tag的质粒,记得IF/WB验证,是必须验证!