APEX2-based Protein Proximal Labeling

APEX2 Proximal Labeling Protocol

Advantage

  1. Capture weak or transient interactive proteins.
  2. Detect proteome at “inaccessible” regions of interest which can not be purified, such as mitochondrial intermembrane space (IMS).

Plasmid

APEX2-V5-POI

POI: proteins of interest

Buffer

  1. 500mM Biotin-phenol母液

称取0.05g Biotin-phenol，溶于278μL DSMO，分装（每管30μL）后-20℃储存.

  1. 500μM Biotin-phenol in 新鲜培养基 1:1000在新鲜培养基中加入500mM Biotin-phenol母液.
  2. 5mM H2O2 in 新鲜培养基（第3步快结束时现配） 5.11μL*30%过氧化氢，加入10 mL新鲜培养基中.
  3. 反应终止液(PBS with 10mM sodium ascorbate, 5mM TROLOX, 10mM sodium azide) 先配置储液0.198g sodium ascorbate in 1mL water (100X), 0.125g TROLOX to 1mL DMSO.

注意这两个储液也不能真的去“储”，使用时现配！

使用时按1:100加入100mL PBS中.
​

  1. RIPA buffer (现加cocktail和PMSF) 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Triton X-100, 使用时现加cocktail和PMSF)有的Protocol推荐：RIPA lysis buffer supplemented with 1× protease inhibitor cocktail, 1 mM PMSF and quenchers (10 mM sodium azide, 10 mM sodium ascorbate and 5 mM Trolox)
  2. 1M KCl溶液
  3. 0.1M Na2CO3溶液
  4. 2M尿素 in 10mM Tris-HCl, pH8.0
  5. 洗脱液(3x protein loading buffer supplemented with 20mM DTT and 2mM biotin)
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Procedure

Biotin labeling

  1. 细胞传至2个10cm板长满
  2. 弃培养基，每个10cm板加入4mL (500μM Biotin-phenol in 新鲜培养基)
  3. 放入37℃ CO2培养箱静置30min
  4. 现配1mL (5mM H2O2 in 新鲜培养基)，立刻从培养箱中取出细胞，迅速将1mL (5mM H2O2 in 新鲜培养基)加入10cm板中(H2O2终浓度1mM)，在手中温柔摇晃孵育1min.不要同时操作超过2盘细胞。
  5. 迅速弃上清，迅速加入4mL反应终止液(PBS with 10mM sodium ascorbate, 5mM TROLOX).
  6. 温柔摇晃5s，弃上清，加入4mL反应终止液.
  7. 温柔摇晃5s，弃上清，加入4mL反应终止液.
  8. 温柔摇晃5s，弃上清，加入2mL预冷的PBS.
  9. 吹打细胞，收集至15mL离心管（两个板2mL+2mL）.
  10. 3000 x g, 4℃, 离心5cm，弃上清，细胞pellet冻存-80℃.

Streptavidin beads enrichment of biotinylated proteins

  1. 冰上解冻细胞.
  2. 加入1.5mL RIPA buffer，吹打混匀，4℃慢速旋转裂解5min.
  3. 15,000 x g, 4℃离心10min，收集上清液，测蛋白浓度.
  4. 取450 μL Streptavidin-coated magnetic beads (Pierce)，RIPA Buffer洗两次.
  5. 弃上清，向beads沉淀中加入8mg蛋白溶液，室温慢速旋转孵育1h或4℃慢速旋转孵育过夜.
  6. 1mL RIPA buffer洗两次.
  7. 1mL 1M KCl溶液洗一次.
  8. 1mL 0.1M Na2CO3溶液洗一次.
  9. 1mL (2M尿素 in 10mM Tris-HCl, pH8.0)洗一次.
  10. 1mL RIPA Buffer洗两次.
  11. 加入75μL (3x protein loading buffer supplemented with 20mM DTT and 2mM biotin)，跑SDS-PAGE和Strep-WB.
  12. 质谱分析.
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Optimization

Control 1 — Negative control [no-H2O2 or no-BP (biotin-phenol)]

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Control 2 — Mass spectrometry control

根据具体的目标蛋白定位来选择，单纯的no-APEX2 or no-H2O2 Control或者别的蛋白construct的Control

Imaging APEX2-V5-POI localization

Optimize Streptavidin pull-down

原文推荐：360 µg (~90 µl) of each whole-cell lysate sample with 30 µl of streptavidin magnetic beads (Pierce).

可以使用小样（6-well plate的一孔细胞，大概2.5Million）进行条件摸索。

Critical points

  1. 不能使用BCA法对蛋白进行定量，Quench buffer中的成分对BCA法有干扰；
  2. 不要在fusion construct中使用HA标签，HA标签可能因为被标记biotin而失效；
  3. 不要同时操作2盘以上细胞，以免影响H2O2标记时间，无法及时终止；
  4. 抗坏血酸钠和TROLOX一定要从干粉现配现用，不能存；
  5. H2O2要在开始使用前几分钟现配，以免分解；