FANA和Morpholino都是通过与目的RNA反向互补发挥作用的Knockdown方法，前者依赖于RNase H对杂交链中RNA的降解实现敲降(RNase H-dependent)，后者不依赖于RNaseH，依靠与靶RNA紧密结合后的空间位阻抑制翻译和剪接实现敲降(RNase H-independent)。

FANA

为了更好的说明FANA的特点，先介绍和它相关的其他种类的ASOs。

已知DNA-RNA hybrid可以被RNase H识别，对杂交链中的RNA进行内切。利用这一原理的ASOs称为RNase H-dependent ASOs. 这一类ASO发挥作用主要需要满足3个条件：

• High RNA binding affinity
• Nuclease resistance
• RNase H activation

即，在保证与靶RNA高亲和力的同时，能够高效激活RNase H的内切活性，同时保证自身能够抵抗核酸酶降解，保持较长的半衰期。为了实现这些条件，需要在天然DNA的基础上进行化学修饰。

硫代磷酸酯键

第一代ASOs将磷酸二酯键上的一个氧原子替换为硫原子，如上图。

优点：

• 合成简单
• 增加了nuclease resistance
• 增加了RNase H activation能力
• 增加了被细胞uptake的能力

缺点：

• 降低了对靶RNA的亲和力（每一个硫代降低0.8℃）//应该指的是杂交链退火温度

2′-O-MOE修饰

如上图所示，2’C后面连1个氧原子，再接一个烷基是常见的修饰方式，碳链越长，nuclease resistance越强，但同时RNA binding affinity变弱。祥鸿在售的是其中的2’-O-methoxyethyl（2’-O-MOE）修饰。

优点：

• 使ASO构象更接近RNA，从而极大增强ASO的对target RNA的binding affinity.

缺点：

• 无法激活RNase H（因为杂交链构象更接近RNA-RNA hybrids而非RNase H需要的DNA-RNA hybrids）

为了利用2’-O-MOE增强RNA binding affinity的优点，同时绕过它无法激活RNase H的缺点，现在通常只在两段几个bases加2’-O-MOE修饰（wings），中间留6~10个bases作为RNase H切割位点（gap），称为”gapmer”技术。

FANA

FANA全称是2’-Deoxy-2’-fluroarabino nucleic acid，（2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸）。要注意它不同于直接在脱氧核糖核苷酸2’碳原子上的2’-F修饰，因为ANA和RNA的2’C上氢原子和羟基的方向不同，见下图。

优点：

• 比2’-O-MOE和ANA更高的RNA binding affinity
• 能够激活RNase H活性（FANA和ANA都可以）
• 无需转染试剂，自身可进入细胞

缺点：

• 相比于磷酸二酯键的DNA并不增加nuclease resistance

由于2’-F修饰本身不增加nuclease resistance，所以骨架也需要硫代磷酸酯键来增加nuclease resistance，即phosphorothioate-FANA (PS-FANA). 然而，在FANA中引入硫代磷酸酯键会在一定程度上降低RNase H activation能力。所以，FANA在被用于ASOs也被设计成PS-(FANA-DNA-FANA) chimeric gapmers或Altimers的形式。

但在FANA的gapmer中的gap不像2’-modification那样需要6~10个bases，”As few as 2 noncontiguous DNA monomers were sufficient for potent RNase H mediated ASO activity”.

Morpholino

最右边的是Morpholino

Morpholino的结构跟上面的ASOs的结构差异较大，用六元的吗啉环代替了五元核糖环，同时用电中性的类磷酸酯键代替磷酸二酯键。它在生物系统中非常稳定，对蛋白酶、酯酶和核酸酶都具有抗性。因为它的稳定和安全，可以使用高于2’-O-MOE的剂量，但在一项小鼠实验中，注射同等剂量的morpholino效果不如2’-O-MOE.

Morpholino无法激活RNase H，它发挥Knockdown作用主要依赖于结合在靶RNA的核糖体识别位点或剪接识别位点抑制翻译或剪接。

Morpholino是电中性的，所以需要特殊的转染方法，其中之一是偶联带电氨基酸。