L1-MS2和MCP-APEX2共转标记RNA临近蛋白
2024.5.2
上午10点开始片段分选
PCR index primer: 131~139.
| 编号 | 浓度（ng/μL） | 20μg对应体积 |
| A | 15.4 | 1.30 |
| B | 16.2 | 1.23 |
| C | 15.2 | 1.32 |
| D | 4.52 | 4.42 |
| E | 5.6 | 3.57 |
| F | 2.88 | 6.94 |
| G | 5.02 | 3.98 |
| H | 3.54 | 5.65 |
| I | 3.9 | 5.13 |
2024.5.1
溶解RNA(6.5ul水)，测浓度
| 编号 | 样品名 | 浓度ng/μl | 体积μl | 补水体积μl |
| A | input ef1a | 152.5 | 0.71 | 2.29 |
| B | input 5utr | 151.3 | 0.72 | 2.28 |
| C | input full | 143.7 | 0.76 | 2.24 |
| D | rep1 ef1a | 43.6 | 2.50 | 0.50 |
| E | rep1 5utr | 50.5 | 2.16 | 0.84 |
| F | rep1 full | 74.9 | 1.46 | 1.54 |
| G | rep2 ef1a | 47.6 | 2.29 | 0.71 |
| H | rep2 5utr | 47.3 | 2.30 | 0.70 |
| I | rep2 full | 43.8 | 2.49 | 0.51 |
建库做到接头连接结束，放4℃过夜。
2024.4.18
做了RIP-seq，EF1a, 5UTR, FULL，各2个replicate，input取了3μl，细胞量每个样品3.5million。
光老师说，PK消化2h那一步，不用加RNase Inhibitor，因为RNase inhibitor本身也是个蛋白，会被PK消化掉。
做到-80℃醇沉了。
2024.4.14
复苏了EF1a, 5UTR和Full到6-well plate，打算做RIP-qPCR和RIP-seq来验证MS2和MCP的相互作用。之前只做过5UTR的，需要补另外两个细胞系的。
2024.4.10
小组会上孙雪妍师姐讲了质谱的初步分析结果，没有拉到任何已知的或推测应该结合的蛋白。
过了两天她又说结果挺好的。
2024.4.8
收到邮件
2024.3.21
下午16:00才到实验室。送了质谱6个tubes，订单标注了DIA定量，问题是去了发现U5-028墙上写着要提前24h预约并通过后才能送。而我是提前1h预约还没通过。打算晚上去看一下他们有没有把我的样品从桌子上收走。
2024.3.20
20:00开始洗昨天17:00开始（共binding了27h）放在4℃旋转结合的L1-MS2 streptavidin beads，每次用200μL buffer洗（都不加cocktail和PMSF）。最后现配Elution buffer，每管加21μL。混匀后95℃煮5min。室温13200rpm离心10min。Flow through取了25μL加入5μL 6xSDS loading buffer，Input取40μg蛋白，补全体积至25μL，加5μL 6xSDS loading buffer. 混匀后95℃煮5min。冰上放了不到2h等电泳槽。然后跑胶。
一共3块胶，两块用来跑Strep-WB，分别是两个replicate，上样顺序是：
Marker, EF1a(input, FL, elute), FullLength(input, FL, elute), 5UTR(input, FL, elute), WT(随便一个没有很多biotin蛋白的阴性对照), Marker
前面的marker是不带PLUS的，后边的是带PLUS的。
后来决定不用两块都做WB了，只有replicate1做了Strep-WB，replicate2做了考染。
第三块用来打质谱，上样顺序是：
Marker, 空, EF1a rep1, 空, Full rep1, 空, 5UTR rep1, 空, EF1a rep2, 空, Full rep2, 空, 5UTR rep2, 空, Marker
都用4~20%的胶。
2024.3.19
化冻了昨天冻的MCP-MS2的细胞，用之前剩的RIPA buffer现加cocktail和PMSF，每个管子（1个6-well孔的细胞量）用了50μl裂解，4℃旋转裂解30min，然后13200rpm 4℃离心15min，收集了60μl细胞裂解液。取了3μL用于测量蛋白浓度（可能由于Buffer的问题导致Bradford测浓度不准，虽然颜色变化正常，但放在nanodrop里读A595数不对，要么是负的，要么是零附近。但用杨乐用WB lysis buffer提的蛋白试了测A595没有问题。最后用肉眼比色，计算了一个大致的蛋白浓度。EF1a的rep1和rep2都是8μg/μL，剩余4个都是10μg/μL）。6个管子的蛋白溶液，各取了200μg×2，用于跟40μL MyOne Streptavidin beads结合（也就是一共12个管子），用RIPA buffer(+cocktail+PMSF)补全体积到200μL，然后在4℃旋转结合，17点开始。
2024.3.18
做APEX2 labeling
上午做了FACS分析，感觉阳性率都可以。
EF1a, FL, 5UTR各两个6-well孔，加0.5mL 含有500uM Biotin-Phenol的培养基，在培养箱静置30min，快结束时，现配1min 5mM过氧化氢（5.11μL*30%过氧化氢，加入10 mL新鲜培养基中.）。30min结束后，每孔加入125μL 5mM过氧化氢。摇晃1min，立刻弃上清。立刻加入终止液(PBS with 10mM sodium ascorbate, 5mM TROLOX, 10mM sodium azide). 现配置储液0.198g sodium ascorbate in 1mL water (100X), 0.125g TROLOX to 1mL DMSO，按1:100加入PBS。本次一共配置10mL终止液即可，每次加0.5mL/孔。加入终止液摇晃3s，立刻弃掉，再加0.5mL终止液，摇晃3s，立刻弃掉，再加0.5mL终止液。弃掉，加1mL冷的PBS，吹打收集细胞至EP管。离心收集pellet，液氮速冻存-80摄氏度。
2024.3.13
2:00 full length的冻了3个孔，L1_5UTR的冻了7个孔。各留了1个已经放在冻存液里的1M细胞。和从液氮罐里取出来的EF1a-tagBFP-MS2(MCP-APEX2)和TetOn-APEX2-V5（1号盒子的45号和2号盒子的51号）一起养在6-well plate
2024.3.10
3:00去郑裕彤医学楼负一层E101A用CytoFLEX S做了FACS分析，这次带了WT对照，用PB450-A表征tagBFP阳性率。WT约0.05%，Full length L1-MS2 约93%， L1_5UTR-MS2约96.7%。发现二者没有因为多次传代而产生显著的阳性率降低。不过full length的细胞没有明显分群（下面中间的图），不知是否值得注意：
L1_5UTR-MS2(MCP-APEX2)传到3个6-well孔（准备冻存），Full length L1-MS2(MCP-APEX2)也传到3个6-well孔了，保持传代，等等复苏的对照组（EF1a-tagBFP那个）。
2024.3.8
18:00 冻存了2个孔的L1(MCP-APEX2)到4个冻存管。
2024.3.6
22:00查看，传代后还没有长满。可以约一个FACS分析了。郑裕彤那个也是膜式的，ZT说最好也预约一下，虽然用的人不多。在一起共享平台预约了CytoFLEX S，医学楼二期E101A，3月7日12:00~12:15。复苏2号盒子28号的L1_5UTR-MS2 (MCP-APEX2)细胞系，这是冻存的最后一管细胞了，一定要谨慎处理。今天复苏，明天去做流式分析（不知道效果如何，因为刚复苏可能状态不好，不行就之后再做一次）
2024.3.7 12:00 在郑裕彤负一层E101A做了FACS分析看了L1-MS2(MCP-APEX2)的荧光，虽然没有带WT对照，但是看PB450的信号感觉根本没有分群。很可能全部沉默了。真奇怪。
看了前一天复苏的L1_5UTR(MCP-APEX2)还没太贴壁，所以就没有做它的流式分析。
2024.3.6
一周后细胞已经长至一个6-well plate，今天传到3个孔的6-well plate了。明天冻存一波，同时流式分析检测一下阳性率还剩多少了。
2024.2.28
复苏冻存的L1-MS2细胞（MCP-APEX2）于24孔板。
2024-02-01
13:30 第二次FACS富集
Full-length L1-ms2收集的阳性率是5%（实际的更高，因为没有紧贴着对照画门），最后收了8万个细胞。
L1 antisense5’UTR在第一次FACS富集后养在96-well没长起来，第一次FACS的阳性率也极低。
L1-MS2富集回来后冻存。