Arp2/3调控转录

Yoo Y, Wu X, Guan JL. A novel role of the actin-nucleating Arp2/3 complex in the regulation of RNA polymerase II-dependent transcription. J Biol Chem. 2007 Mar 9;282(10):7616-23. doi: 10.1074/jbc.M607596200. Epub 2007 Jan 12. PMID: 17220302.

文献总结

研究目的

本研究旨在探索actin-nucleating Arp2/3 complex在RNA聚合酶II依赖的转录中的新作用，尤其是其在细胞核中的定位及其通过N-WASP介导的肌动蛋白聚合对转录调控的影响。

背景

  • Actin已知存在于细胞核中，并参与包括转录调控在内的多种核功能。
  • Arp2/3 complex在细胞质中的作用已被广泛研究，其主要通过WASP家族蛋白激活，促进肌动蛋白的成核和分支形成。
  • 近期研究表明N-WASP能够在细胞核内诱导肌动蛋白的de novo聚合，这对于RNA聚合酶II依赖的转录调控至关重要。

实验设计与结果

  1. 核定位研究：
  • 通过免疫荧光显微镜和Western blotting分析，确定Arp2和Arp3在细胞核中的定位。
  • 结果表明，Arp2和Arp3不仅存在于细胞质中，还在细胞核中有显著定位。
  1. siRNA介导的蛋白质敲低：
  • 使用特异性siRNA敲低HeLa细胞中的Arp2和Arp3，结果显示，这些蛋白在细胞核中的含量显著降低，进一步验证了其核定位。
  1. pyrene actin assays：
  • 在体外实验中，研究了Arp2和Arp3对N-WASP介导的肌动蛋白聚合的影响。
  • 结果表明，敲低Arp2或Arp3会显著减少肌动蛋白聚合，而添加纯化的Arp2/3复合物可以恢复聚合活性。
  1. 转录调控研究：
  • 使用BrU掺入实验和体外转录实验，评估Arp2和Arp3在RNA聚合酶II依赖转录中的作用。
  • 结果显示，敲低Arp2或Arp3显著降低了转录活性，而具有siRNA抗性的Arp2和Arp3突变体可以恢复转录。

讨论

  • 本研究提供了强有力的证据，表明Arp2/3 complex在细胞核中通过调控肌动蛋白聚合参与RNA聚合酶II依赖的转录。
  • 提出N-WASP和Arp2/3 complex可能通过类似于其在细胞质中的机制，在细胞核内调控转录。
  • 未来的研究需要进一步探索核肌动蛋白的聚合机制及其在基因转录和其他核功能中的作用。

创新点与不足

  • 创新点：首次明确了Arp2/3 complex在细胞核中的功能，拓展了其已知的细胞质作用。
  • 不足：主要依赖体外和细胞实验，尚需在体内研究中验证这些发现的生理相关性。

这篇文章通过一系列实验，揭示了Arp2/3 complex在细胞核中的新角色及其对RNA聚合酶II依赖转录的重要影响，为理解细胞核内肌动蛋白的功能提供了新的视角。

Generated by ChatGPT 4o

Figure 5的实验很巧妙，作者发现用siRNA KD Arp2和Arp3后Pol II转录下降。然而，这种下降是否是由“nuclear Arp2/3”而非“cytoplasmic Arp2/3”的KD所引起的呢？为了研究这一点，作者往Arp2/3的后边加了核输出信号NES (nucleus export signal)，这样外源导入的Arp2/3-NES就只定位在细胞质中，同时，引入同义突变使得siRNA只能沉默内源Arp2/3，而无法沉默外源导入的、定位在细胞质的Arp2/3-NES，从而实现了只KD nuclear Arp2/3的实验设计。

在此基础上作者还设置了严谨的对照。通过突变改变NES的疏水性残基（如亮氨酸），使其失去核输出功能（NESm）。相比于Arp2/3-NES只定位在细胞质，Arp2/3-NESm就即定位在细胞质，也定位在细胞核，作为“阴性对照”。

siRNA处理内源Arp2/3，干扰了Pol II介导的转录。

在外源导入的Arp2/3中引入不改变氨基酸序列的同义突变，这些突变后的Arp2/3免疫siRNA。

NES信号使蛋白定位在细胞质，而NESm在核质均有定位。

只沉默nuclear Arp2/3就可以影响Pol II介导的转录（lane 3和lane6）。