copGFP
文献中看到有一种”copGFP”，是一种比EGFP信号更强（~1.3倍）的绿色荧光蛋白，来源于copepods（桡足类）的Pontellina sp.（细角类属）。
copGFP的属性
pGreenZeo载体包含了经过优化的人类密码子全长copGFP基因，以便从CMV启动子在哺乳动物细胞中高水平表达荧光蛋白。copGFP标记是一种来自桡足类（Pontellina sp.）的天然绿色单体GFP类似蛋白。copGFP的一个独特特征是在蛋白的C端存在一个附加的去稳定化（ds）肽段，这使得成熟蛋白的半衰期在不需额外转录的情况下缩短至1小时。copGFP蛋白是一种无毒、不聚集的蛋白，具有快速的蛋白成熟、高稳定性（在pH范围4-12内），且不需要任何额外的辅因子或底物。copGFP蛋白具有非常明亮的荧光，其亮度至少是广泛使用的Aequorea victoria GFP突变体EGFP的1.3倍。copGFP蛋白发出绿光荧光，其特性如下：
- 发射波长最大值 – 502 nm
- 激发波长最大值 – 482 nm
- 量子产率 – 0.6
- 消光系数 – 70,000 M^-1 cm^-1
由于其卓越的性能，copGFP是一种优秀的荧光标记，可以代替EGFP用于监测慢病毒构建体进入细胞的过程。
Microsoft Word – Manual-pGreenFire-ver-082412_yk edited.docx (systembio.com)
我只能从质粒上得到一个800多bp的序列，这个copGFP的序列跟EGFP相似度非常低，双序列比对只有27.4%的similarity，上面引文中提到了在C端加了一个”destabilizing (ds) peptide”，我想看看natural copGFP是否包含这一段来着，但是blastp和blastn都在Pontellina sp.中找不到，可能是因为这个属太冷门，没有太多数据库信息。这篇文章的Figure. 4B.中将这800多bp的序列标记为GFP-PEST，chatGFP对”PEST”的介绍是：
PEST Sequence:
chatGFP 4o
- The PEST sequence is a peptide sequence rich in proline (P), glutamic acid (E), serine (S), and threonine (T). This sequence is known to target proteins for rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway.
- Proteins containing PEST sequences are typically short-lived due to their rapid degradation.
在NCBI中不指定物种做blastp，得到的所有query都只cover到前半段，应该说明C端的PEST序列是这个质粒的构建者单独加上去的，所以我自己以后就把这段序列标记为”copGFP-PEST”了，提醒自己不要忘记它不是EGFP，同时半衰期只有1h。
半衰期短意味着荧光信号不容易累积，方便做dynamic的观察，另一方面荧光信号不容易达到上限（过曝），所以可能对不同样本/细胞中荧光信号强弱的区分度大一点。
以下是copGFP-PEST的核酸序列（已经过适合human细胞表达的密码子优化）：
>copGFP-PEST
ggaggttctgcccccgccgccaagatcgagtgccgcatcaccggcaccctgaacggcgtggagttcgagctggtgggcggcggagagggcacccccgagcagggccgcatgaccaacaagatgaagagcaccaaaggcgccctgaccttcagcccctacctgctgagccacgtgatgggctacggcttctaccacttcggcacctaccccagcggctacgagaaccccttcctgcacgccatcaacaacggcggctacaccaacacccgcatcgagaagtacgaggacggcggcgtgctgcacgtgagcttcagctaccgctacgaggccggccgcgtgatcggcgacttcaaggtggtgggcaccggcttccccgaggacagcgtgatcttcaccgacaagatcatccgcagcaacgccaccgtggagcacctgcaccccatgggcgataacgtgctggtgggcagcttcgcccgcaccttcagcctgcgcgacggcggctactacagcttcgtggtggacagccacatgcacttcaagagcgccatccaccccagcatcctgcagaacgggggccccatgttcgccttccgccgcgtggaggagctgcacagcaacaccgagctgggcatcgtggagtaccagcacgccttcaagacccccatcgccttcgccagatctcgagatatcagccatggcttcccgccggcggtggcggcgcaggatgatggcacgctgcccatgtcttgtgcccaggagagcgggatggaccgtcaccctgcagcctgtgcttctgctaggatcaatgtgaccggt
蛋白序列为：
copGFP-PEST
GGSAPAAKIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVVGTGFPEDSVIFTDKIIRSNATVEHLHPMGDNVLVGSFARTFSLRDGGYYSFVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEELHSNTELGIVEYQHAFKTPIAFARSRDISHGFPPAVAAQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINVTG