记录一下最近犯的一个蠢错误。做个融合PCR，因为想当然跳了一步，结果浪费了一周多时间。
实验很简单，就是要把一个带EGFP的“标签”换成mCherry。用两步Overlap PCR：
- 先P出mCherry片段，一端带上和“标签”一样的overlap区段。同时P出“标签”中没有EGFP的另一半。
- 把mCherry产物和“标签”做融合。
问题出在第一步PCR之后。
挂胶看了眼，条带很亮很单一，就动了歪脑筋：这么干净，还切胶回收干嘛？直接稀释了当模板用，省事。
于是跳过了胶回收，直接做了后续的融合、转化、送测序。
结果，送去测序的克隆，一堆都是错的。最离谱的是，很多克隆里根本没有mCherry，还是原来的EGFP。
想了半天，终于明白了。就是因为没做胶回收。
第一步的PCR产物里，虽然看着干净，但肯定有微量的EGFP模板残留。到第二步融合的时候，因为mCherry和EGFP序列高度相似一样，引物根本没法区分，就把残留的EGFP模板也给P出来了。（更重要的是我还没有做“不加引物，预先让overlap延伸”的步骤，直接就加两头的引物P了）
所以最后产物里混了一堆带EGFP的错误片段。
啊！！就为了省那一两个小时，结果耽误了一周多，试剂测序费全白瞎了！
结论就是：切胶回收，就老老实实切。PCR产物看着再干净，也信不过。不加引物先反应，也不要跳过这个步骤。老老实实按protocol做才是最快的。虽然，只要设计的时候考虑完善，确实也可偷懒省略（这次是EGFP和mCherry序列相似度太高翻车的），但是人总会百密一疏，多“愚蠢”一些，也许长远是更省时间的。