红颜弹指老

    2024.3.1

    昨晚虽然早早躺在床上，但直到凌晨2:00或3:00才入睡。今天醒来已经是下午13:30。起床后，看了两集更新的视频。洗澡后，在15:00左右去了牛拉，点了份大盘鸡饭。

    回忆起自己曾设定过的14小时工作法——从进入实验室开始计时，连续工作14小时，期间只简单用餐。决定今天再次尝试这种方法。于是从15:30开始计算，预计持续到明早5:30。

    首先，检查了实验室中的细胞：24孔板里的L1-MS2细胞和野生型NCCIT细胞。结果发现，两种细胞都已经可以传代。L1-MS2细胞将按照1:3的比例传代，并准备转染RLIG1质粒；NCCIT细胞则传代到相邻孔内。同时，还配制了一瓶新的1640培养基。

    接着，考虑分析之前ASW-dTAG构建失败的原因，决定从NCCIT野生型基因组测序入手，通过PCR和一代测序验证基因组情况。根据计划，选择了相应的引物进行PCR反应，并配制了凝胶。此时，时间来到了17:30，工作了约2小时，剩余12小时。

    查阅了之前构建的N-ASW-dTAG和C-ASW-dTAG质粒测序结果，发现符合预期，表明同源臂在基因组中存在。基于此，计划选择合适引物进行后续测序。N端产物选用两端引物及4226N-ASW-vR2；C端产物则采用两端引物及C-ASW-seqF2。

    19:00时，将测序带放入仪器，并在等待期间浏览手机。20:00开始参加组会，主讲人为ZT。组会上了解到刘洪江即将退学，赴国外攻读博士学位的消息，内心颇感复杂。

    组会结束后，整理了需要查询的几个知识点：H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac等组蛋白修饰的意义，super enhancer的概念以及Pol II 2P和5P的含义。

    21:45组会结束。之后查阅资料，整理了组蛋白甲基化和乙酰化修饰的相关信息，并确认了这些修饰可以通过ChIP-seq技术测定。实验室中也找到了相关的抗体。

    随后，开始研究super enhancer的相关概念，并决定阅读Richard A. Young提出的关于super enhancer的开创性论文，并制作讲解视频。

    读论文的过程中，发现自己容易分心，多次中断去浏览社交媒体。最终，在5:42完成了论文的阅读，决定在下次工作中整理成文字和视频笔记。

    下班！

    2024.3.3

    下午16:00醒来，准备起床吃饭。今天的主要任务包括处理毛师兄的实验记录、准备女生节活动、进行细胞转染等。洗澡、吃饭后，前往综合体育中心给龙新、冠勋和张世锬送女生节明信片。18:00抵达实验室，开始第二个工作日，计划次日早上8点下班。

    今天需要完成的任务：传代L1-MS2细胞并转染RLIG1-APEX2；检查ASW-dTAG质粒构建并重新设计实验流程；观看毛师兄发的基金资料；接手张涛的ANKRD11-APEX2构建；复习Ecoli RTCB 5’OH RNA seq并检查试剂；撰写super enhancer的帖子；准备女生节活动等。

    18:46开始传代细胞，并冻存WT NCCIT细胞。19:34完成细胞操作，设定了早上8点的闹钟提醒自己转染细胞。查看前一天的测序结果，未发现大问题。

    20:00，总结了毛师兄的研究成果，发现MCP1基因影响2-苯乙醇的产量，并通过调控ARO8, ARO9, ARO10的蛋白水平实现这一作用。总结完毕后，决定先复习ASW-dTAG实验记录，并观看相关教学视频。

    22:47，看完教学视频后，开始设计修复质粒的引物，并思考在细胞系构建过程中设置检查点的方法。23:21，梳理完流程后，决定在转染后48小时富集mCherry阳性细胞，并在10天后再次富集GFP阳性细胞。

    23:40，下楼取外卖，并休息片刻。1:20，吃完螺蛳粉后，开始设计引物并提交订单。4:00，完成引物设计，耗时2.5小时。总结当天工作，决定调整工作时间为10小时，而非14小时。

    5:11，决定下班，并计划次日下午进行细胞转染。

    看对方这个反馈，应该是没啥帮助……

    2024.3.4

    突然想起来我不用流式啊，赶紧取消了。我是药杀的。

    2024.3.5

    1:07开始新的10小时工作计划，目标在11:07下班。主要任务包括：

    1. 完成super enhancer文章的文字版笔记和视频发布。
    2. 阅读一篇LINE-1 RNA相关文章并做笔记。
    3. 复习Ecoli RTCB 5’OH RNA seq的protocol并检查药品。
    4. 等待引物到货后进行PCR。
    5. 接手张涛的ANKRD11 APEX2 knockin质粒。

    首先整理super enhancer的文字笔记，实际在3:18完成。随后制作PPT并录制视频，5:03上传至B站和小红书。

    此时距离下班还有6小时，决定休息并吃泡面。6:00结束休息，准备阅读LINE-1 RNA相关文献，但由于疲惫，决定先休息。

    7:45醒来，依然困倦，未能有效阅读文献。决定等待引物到货后再进行PCR。

    11:00醒来，实际只完成了4小时工作。考虑改为5小时工作制。

    晚上23:00开始新的5小时工作计划，目标在次日4:00下班。首先进行跑胶，发现胶已干裂，重新配胶后更换细胞培养液。

    2024.3.6

    今天工作特别辛苦，早上4:30完成了质粒构建的涂板工作。回到宿舍后，从7:00一直睡到10:00。起床后，前往圆明园查看训练场地的情况，活动一直持续到下午13:00。期间，我还抽空写了一些活动策划的内容。

    14:30左右去吃了午饭，之后回到了寝室。下午16:30感到有些疲惫，再次休息了一会儿，直到20:00才醒来。在床上稍微躺了一会儿后，于21:00出门吃了晚饭。晚上22:00到达实验室，却发现有一个平板没有长菌，心里有些失落。

    决定从22:00开始一个新的5小时工作计划，直到次日凌晨3:00。首先挑选了克隆，并检查了细胞是否需要更换培养液。接着，我开始查找C-ASW-dTAG构建中可能存在的问题。如果有必要的话，还需要设计新的引物并对N-ASW-dTAG进行PCR鉴定。

    22:20开始摇菌，22:52开始复苏WT和L1_5UTR-MS2(MCP-APEX2)细胞。

    到了凌晨2:00，重新酶切了C-ASW-dTAG的片段和载体，并对N-ASW-dTAG进行了PCR鉴定。张涛提供了ANKRD11-APEX2-KnockIn的图谱，我根据图谱开始设计引物。

    没想到这次工作远远超出了预定的5小时，一直忙到了凌晨5:30，实际工作了7.5小时。

    中午12:00，查看了L1(full length)-MS2的流式数据，遗憾的是缺少了WT对照组的数据。

    2024.3.8

    今天从15:30开始工作，计划在17:00结束。首先进行了ANKRD11和C-ASW-dTAG的PCR，接着检查了细胞状态。此外，还需处理流式数据。

    PCR设置了一个小时的运行时间，打算在这期间小憩一下。原本计划1点开始休息，2点继续工作，结果一觉醒来已经是5点了。

    上午从吃早饭开始忙碌，一直干到九点多，之后在楼道的沙发上休息，直到11点才醒来。休息过后，去划船放松了一下。

    2024.3.9

    晚上22点40分到达实验室，开始了新一轮的工作。今晚的主要任务包括：

    1. 构建完C-ASW-dTAG并完成涂板。
    2. 构建完ANKRD11-APEX2并完成涂板。
    3. 构建完ANKRD11-P2A-APEX2并完成涂板。
    4. 将APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2传代至不加药培养基，并复苏APEX2-V5对照。
    5. 通过Western blot验证构建好的APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2细胞系中存在V5-tag。
    6. 传代L1(5UTR)-MS2(MCP-APEX2)，并准备冻存。
    7. 提取N-ASW-dTAG质粒，并放置于-80℃醇沉。
    8. 将L1(full length)-MS2(MCP-APEX2)放入液氮罐保存。
    9. 对L1(5UTR)-MS2(MCP-APEX2)和L1(full length)-MS2(MCP-APEX2)进行流式分析，并提前查询不同荧光通道对应的波长。

    工作到次日5:00，总共工作了6.33小时，期间只休息了13分钟。除了“复苏APEX2-V5对照”之外，其余任务均已顺利完成。现在感到极度困倦，准备回去睡觉。

    2024.3.12

    回顾过去几天的情况：

    • 3月10日在TBT划船，没有记录日记。
    • 3月11日组织了圆明园的活动，也没有记录。但实际上，3月10日晚上到3月11日凌晨4:00一直在做实验。3月11日晚上回到家后太累了，直接睡到了3月12日下午。

    今天，老板通知16:30召开小组会议汇报工作，只剩下1.5小时的时间，我计划完成三件事情：

    1. 去荷塘查看水位。
    2. 去西体育馆确认晚上是否可以登记并训练。
    3. 完成昨天龙抬头的推送。

    16:20时，只完成了第3件事情。

    下午开完小组会议后，前往苏世民书院与启元讨论了训练安排，并在途中查看了荷塘水位，认为情况良好。晚上训练结束后，询问了西体育馆的可用时间，得知周一、周四晚上18:30到22:30可以加练。

    今天几乎忙到了深夜，可以说又没有完成多少实验工作。

    2024.3.13

    0:00检查了细胞状态，发现：

    • APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2可以1传3，准备冻存。
    • L1_5UTR可以冻存，留1/3的6孔板细胞继续传代。
    • L1_full也可以冻存，留1/3的6孔板细胞继续传代。
    • SRP9的dTAG开始加药，计划10:00收获细胞。

    早上7:00起床，8:00对SRP14的dTAG开始加药。

    下午2:27，完成了所有细胞的操作。开始记录实验并查看测序结果。在实验室休息到早上7:50，然后开始给SRP14加药。

    2024.3.14

    15:50，先把抗体拿出来化冻。然后整理一下最近的龙舟队照片。上传到网站。

    晚上23点敷上了一抗，anti-HA找ABclonal的发现不够了，于是用了CST的C29F4.然后就下班了。因为太困。

    2024.3.15

    今天16:00到达实验室，首先从4℃冰箱中取出Western Blot膜，开始洗涤一抗。期间配制了2升的PBST，时间来到16:30。

    随后检查了细胞状态，由于已经接近72小时未处理，原计划冻存的APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2需要再传代一次才能冻存。

    今天的任务包括：

    1. 订购P2A质粒的新引物。
    2. 传代细胞。
    3. 检查用于APEX2 labeling的试剂。
    4. 摇菌，准备C-ASW-dTAG和不带P2A的ANKRD11质粒。
    5. 开始阅读文献，不限数量，重在开始。
    6. 完成Western Blot实验并获取结果。

    16:50时，开始接菌。

    2024.3.18

    今天16:00到达实验室，决定先处理之前摇的菌，扔掉旧的菌液，计划重新接菌。

    当前的主要任务包括：

    1. 分析L1-MS2的FACS数据。
    2. 进行APEX2-RLIG1的V5 Western Blot。
    3. 对L1-MS2进行APEX2 labeling。
    4. 给APEX2-RLIG1加dox，24小时后进行APEX2 labeling。
    5. 给SRP9和SRP14加dTAG。

    昨晚0:45添加了dox和dTAG，今天早上9:15开始上班。先给SRP14添加2小时的dTAG，计划11:20收集细胞做Western Blot。

    传代保种的SRP9和SRP14单克隆到12孔板，并收集加过dox的细胞，暂时冻存于-20℃，稍后与SRP细胞一起裂解提取蛋白。

    下午检查了EF1a/fulllengthL1/L1_5UTR-tagBFP-MS2的蓝色荧光阳性率，结果均较好。

    14:27测量了蛋白浓度，并计算了每种样品所需的体积。计划进行四块凝胶电泳。

    下午还进行了EF1a-tagBFP-MS2, L1_ORF1-tagBFP-ORF2-MS2和L1_5UTR-tagBFP-MS2的APEX2 labeling，每个样品2个6孔孔，细胞pellet液氮速冻后冻在-80℃。

    2024.3.19

    今天是阳间做实验的一天，九点多到实验室开始工作。原计划昨晚23点来实验室，但因困意未执行。Western Blot膜在室温封闭了十几个小时，今天查看时发现信号较弱。原本计划昨晚进行RLIG1的APEX2 labeling，但由于细胞生长过满，只能重新传代铺板。

    一抗可能室温1小时的效果不如4℃过夜，下午观察Western Blot结果时发现信号较浅。anti-V5只检测到了APEX2-V5，未检测到APEX2-V5-RLIG1和RLIG1-V5-APEX2，可能是因为被切割掉了。所有PVDF膜已放置在4℃，计划明天再进行长时间曝光。

    化冻了昨天冻存的MCP-MS2细胞，使用RIPA buffer加cocktail和PMSF裂解细胞，每管（1个6孔孔的细胞量）用了50μl裂解液，4℃旋转裂解30分钟后，13200rpm离心15分钟，收集了60μl细胞裂解液。取3μl用于测量蛋白浓度，但Bradford法测得的结果不准确。最终通过肉眼比色估计了蛋白浓度，EF1a的rep1和rep2均为8μg/μL，其他四个样品均为10μg/μL。

    取了200μg蛋白与40μL MyOne Streptavidin beads结合，用RIPA buffer补充至200μL体积，4℃旋转结合，从17点开始。

    同时提取了多个质粒，包括C-ASW-dTAG、ANKRD11-N-APEX2-PGEMT、sg1、sg2、sg3。张涛建议使用PB-TetOn-APEX2-V5-BSD作为质谱对照。交付了ANKRD11-N-APEX2-PGEMT，自己的C-ASW-dTAG和另一个N-ASW-dTAG放置在-80℃醇沉，计划明天一起洗出用于ASW-dTAG的转染。

    上午还传代了NCCIT WT细胞，并请教了光老师的转染经验。每个6孔孔用200μL opti-MEM培养基稀释3个质粒各1.5μg，共计4.5μg质粒，加入13.5μL Viafect，混合20分钟后放入一个6孔孔。

    14:35检查了细胞密度，认为RLIG1的dox应在明早添加更为合适。WT细胞也有些稀疏，ASW-dTAG的转染同样适合在明早进行。

    2024.3.20

    今天13:15才到实验室，昨晚讨论队伍管理问题，睡得很晚，导致起床晚了，耽误了不少时间。

    今天的任务包括：

    1. 洗出醇沉的N-ASW-dTAG和C-ASW-dTAG。
    2. 下午3点参加小组会，听说以后每周三都要开正式会议。
    3. 准备ASW-dTAG的转染（由于细胞太稀疏，推迟到明天）。
    4. 处理L1-MS2蛋白，进行washing和eluting，并准备跑胶。
    5. 预约共享仪器平台的EQ（用于转染后48小时的ASW-dTAG阳性富集）。
    6. 预约DIA-MS，计划明天上午送样。
    7. 显影昨天放在冰箱里的SRP9/14单克隆的WB结果，并整理结果图。
    8. 查明APEX2-V5-RLIG1未曝光出条带的原因。
    9. 给今天铺在6孔板的APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1和RLIG1-V5-APEX2加dox（推迟到明天）。

    查了蛋白质大小：APEX2-V5 28.4kDa，APEX2-V5-RLIG1 和 RLIG1-V5-APEX2 均为66.7kDa。V5带确实在25和35kDa之间，但其他两个没有带。计划重新跑胶，加入-80℃冻存的AV和AVR做阳性对照。

    14:07，开始热培养基，准备加dox，并离心N-ASW-dTAG和C-ASW-dTAG质粒，计划在组会前洗出质粒。

    17:00，计划重新过夜孵育SRP14的一抗，之后与SRP9的一起孵育anti-ACTB。冻存SRP9N的9号和16号，SRP14C的44号、54号和55号，各2管。

    20:00，开始洗昨天17:00开始binding的L1-MS2 streptavidin beads，每次用200μL buffer洗。最后现配Elution buffer，每管加21μL，混匀后95℃煮5分钟。室温13200rpm离心10分钟。Flow through取25μL加入5μL 6xSDS loading buffer，Input取40μg蛋白，补全体积至25μL，加5μL 6xSDS loading buffer，混匀后95℃煮5分钟，冰上放置不到2小时等电泳槽，然后跑胶。

    一共3块胶，两块用来跑Strep-WB（一个replicate做了Strep-WB，另一个做了考染），第三块用来打质谱。

    2024.3.21

    今天下午16:00才到实验室。送了质谱6个管子，订单标注了DIA定量，但发现需要提前24小时预约并通过审核才能送样。而我只是提前1小时预约，尚未通过审核。打算晚上去看看样品是否已被收走。

    完成了重新孵育一抗的SRP14鉴定WB，但无法解释为什么anti-SRP14没有任何条带，原来的条带也不见了。anti-HA的条带比之前强一些，可以看出SRP14C 55#号单克隆在2小时5000倍稀释的dTAG处理下不能完全降解（比1/4 0h要强），但还没有孵育actin。计划过夜孵育β-actin。

    下午18:30进行了N-ASW-dTAG和C-ASW-dTAG的转染，但转完后发现48小时后是周六，无法使用流式富集。因此预约了明天周五16:30的流式富集，这样不足24小时，效率可能不高。同时铺了3个WT孔，计划周六上午11点重新转染，并预约了周一12:00~12:30的新馆317 EQ富集，打算将这两次富集的细胞合并。

    下午18:30对APEX2-RLIG1的三个细胞系加了万分之一的dox，每个细胞系两个6孔孔，计划24小时后进行APEX2 labeling。

    2024.3.22

    下午16:30去EQ富集了ASW-dTAG，收集了约25W细胞。本来打算48小时再富集来着，但是没算好时间，只能卡在周五下午不足24h去分。不过这次收的细胞数量足够多（上次失败的只有1.5W）。回来后养在24孔板。

    晚上显影完了SRP14的两张actin，然后把APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2的标记给做了。还是带上APEX2-V5做对照，dox万分之一诱导24h，每个细胞系2个6-well孔，过氧化氢1mM孵育1min后终止（不过我实际操作时注意到，等到加终止剂其实已经快1.5min了），细胞pellet液氮速冻后存在-80℃了，没有继续往下做，因为目前这两个细胞系还未通过WB鉴定（anti-V5砸不到带）

    2024.3.25

    发现C-ASW-dTAG污染了，重新转，重新约流式。WT重新铺了板。

    2024.3.27

    重新转染了C-ASW-dTAG，转染条件跟上次完全相同。用RLIG1抗体和V5抗体（都是rabbit）跑了APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2的WB，用的蛋白还是上次冻在-20的。APEX2-V5的不够了，理论上30μg应该上样4.9μL，但是实际上只上样了3.5μL。

    2024.3.29

    中午12:00进行了27号转染的C-ASW-dTAG的分选，富集了大约80万个细胞，阳性率超过30%。

    之前认为22号富集回来的C-ASW-dTAG受到污染，但今天检查后发现并非污染。于是将细胞传代到了6孔板。

    N-ASW-dTAG在6孔板中长满了，因此将其传代到了一个10厘米的培养板中。

    预约了2024年3月31日（周一）下午14点到15点的EQ，计划将22号富集的N-ASW-dTAG和C-ASW-dTAG打板并收集population。

    重新做的用anti-V5 (rabbit)和anti-RLIG1 (rabbit)的RLIG1的Western Blot结果显示，两种抗体都能检测到正常大小的条带。之前未能检测到可能是由于实验失误未将样品正确上样到胶孔中。

    2024.4.1

    下午14:00在显微镜下看了22号富集的N-ASW-dTAG（在10cm板）和C-ASW-dTAG（在6-well plate），都没有看到GFP信号，但还是抱着侥幸心理去FACS富集了。

    重新配置了RIPA buffer。

    水38mL
    1M Tris (pH7.5)2.5mL
    5M NaCl1.5mL
    10%SDS0.5mL
    10%脱氧胆酸钠2.5mL
    10% Triton X-1005mL
    50mL RIPA buffer

    从-80℃冰箱取出22日标记的APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2细胞（各2管），加入55μL RIPA (+cocktail +PMSF)，4℃旋转30min裂解细胞，14000rpm离心15min（这里出现了失误，离心机温度设置错了，应该是4℃，实际是25℃）。保留上清。

    测蛋白浓度：

    V5 rep16.73ug/ul
    V5 rep221.04ug/ul
    APEX2-RLIG1 rep15.51ug/ul
    APEX2-RLIG1 rep25.85ug/ul
    RLIG1-APEX2 rep15.63ug/ul
    RLIG1-APEX2 rep27.66ug/ul
    BradFord测的，两次标准品的A595不一样， 用了第二次的，费解

    计划和上周做L1-MS2的实验一样，每个tube里取两份200ug蛋白出来，分别与40ul MyOne Streptavidin beads孵育来着，但是计算了一下这次的浓度不够每个tube 400μg蛋白，所以每个管中取出了300μg蛋白，加60μL beads孵育。打算打质谱还是用200μg蛋白，但是跑考染和Strep-WB的上样减半。

    19点开始在4℃旋转孵育。

    2024.4.2

    复苏到12孔板：SRP9C-5,9,22,28,34; SRP14C-37,42,44,54,55，都是NCCIT中的dTAG单克隆。

    打算做RIP和RNA-seq，RIP可以5个单克隆混起来变成一个样品做，RNA-seq要单独做。

    将第二批转染的C-ASW-dTAG穿代，从6-well孔到6-well孔，铺的更加分散一点。

    2024.4.3

    3:00取出在4℃旋转的APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2.共6个tube，（一共binding了32h）。收集Flowthrough。

    200μL RIPA buffer洗两次.

    200μL 1M KCl溶液洗一次.

    200μL 0.1M Na2CO3溶液洗一次.

    200μL (2M尿素 in 10mM Tris-HCl, pH8.0)洗一次.

    200μL RIPA Buffer洗两次.

    30μL  (3x protein loading buffer supplemented with 20mM DTT and 2mM biotin)洗脱，95℃煮5min。

    用了3块4~20% 15-well蛋白胶。

    第一块做考染：Marker(plus), APEX2-V5 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), APEX2-V5-RLIG1 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), RLIG1-V5-APEX2 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), Marker

    第二块做Strep-WB: Marker(plus), APEX2-V5 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), APEX2-V5-RLIG1 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), RLIG1-V5-APEX2 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), Marker

    SE068 Strep-HRP 1:2K

    第三块考染、打质谱DIA-MS: Marker(plus), APEX2-V5 Elute 20μL(rep1, rep2), APEX2-V5-RLIG1 Elute 20μL(rep1, rep2), RLIG1-V5-APEX2 Elute 20μL(rep1, rep2), Marker

    下午送了质谱。

    2024.4.5

    18:00加药dTAG，稀释5000倍。之后48h没有换液，也没有在显微镜下观察。

    2024.4.7

    19:00查看SRP9和SRP14单克隆。发现部分细胞死亡。

    不加药板1：SRP14C-54#死亡

    不加药板2：SRP14C-54#死亡

    加dTAG 48h板1：SRP14C-37,42,54,55死亡

    加dTAG 48h板2：SRP9C-34, SRP14C-37, 42, 44, 54, 55死亡

    RNA-seq做了SRP9C-5,9,22,28,34和SRP14C-44的。12-well孔中弃掉培养基直接加300μL TRIzol Reagent，收集到-20℃暂存。

    RIP-seq做了SRP9C-5,9,22,28混。

    SRP14-37,42,44,55重新铺板（每个12-well孔0.2million细胞），准备重新做RIP-seq和RNA-seq.

    每个样品都是40μL Dyna ProteinG beads，用5μl anti-SRP9(proteinTech)或anti-HA(CST, C29F4)。每个样品4百万细胞。

    SRP9C no-dTAGSRP9C +dTAG 48h
    input 3μlinput 3μl
    anti-SRP9 replicate1anti-SRP9 replicate1
    anti-SRP9 replicate2(beads抗体只包了30min）anti-SRP9 replicate2 (beads抗体只包了30min)
    anti-HA replicate1anti-HA replicate1
    anti-HA replicate2anti-HA replicate2

    4℃ binding 23:00~3:00 (4h）

    2024.4.9

    18:00给SRP14单克隆加dTAG。

    2024.4.10

    22:00左右观察SRP14单克隆，发现已经长得爆满了，赶紧传代。加药的继续加药，不加药的继续不加药。

    SRP9的RIP-seq建库做到末端修复完成了。在4℃放着等4月12号继续做。

    复苏了ANKRD11-N-APEX2-V5-pGEMT和TetOn-APEX2-V5细胞系到6-well plate，打算长起来做APEX2 labeling.

    2024.4.14

    突然发现我的摆烂日记怎么变成实验记录了。不行，它应该记录我的整个摆烂生活。

    昨天是周六，去一天自然划了船。晚上9点就入睡了，但是两点就醒了，然后玩手机到七点半。去实验室整理了龙舟队上个月的照片，发了几篇从公众号转的博文。送样了吉因加的测序。

    10:34，打算开始整理一下实验计划。我马上要博资考，好烦。什么都没开始准备。

    2024.4.26

    今天24点截止提交博资考的proposal，我又陷入了 一边焦虑 一边摆烂 的情绪怪圈中。I must tell myself again and again. Don’t stop. No matter what am I thinking about. Don’t stop on actions.

    2024.4.28

    昨天和今天是校庆日。自强师兄是我的博资考秘书，因为我没有按时提交proposal，他说最后一次的截止期限是周一（也就是明天）。但是今天我又踏踏实实在床上躺了一整天。昨天晚上开始哦熬夜，早上六点才放下手机睡觉，然后十二点醒了又开始刷手机，一直到下午六点，去清青快餐吃了今天唯一一顿饭。然后在宿舍整理了一下内务。把许久没用过的桌子和椅子清理了一下。心血来潮买了个台式机。因为我昨晚在设置博客的css，但是因为只有手机，手机上不能按f12，所以消耗了大量的时间。我认为堵不如疏，既然自己真的有这个爱好，那就为这个爱好创造条件，而不是强迫自己放下这个爱好去搞科研。选了京东快递，今天21点下的单，明早9～11点送达宿舍。【联想天逸510s i5-13400】算上一个很基础的显示器一共四千块。

    还有一个有趣的事情，我发现我给ipad配的妙控键盘（平替版）竟然也可以直接连接手机，这样打字就方便太多了。我于是可以坐在我宿舍收拾好的桌椅、用蓝牙连接的妙控键盘，在手机上写“摆烂日记”，体验非常好，这是我今天最开心的事情。

    2024.5.6

    五一假期结束了。复盘一下，5.1~5.2在跟一个秦为课题组的师姐一起做RIP-seq的建库。5.3在宿舍睡了一天，5.3的晚上正在宿舍玩MC的时候老板问了TypeIII CRISPR的进展。然后让上海科技大学的池天教授组的马恒源师兄寄过来了质粒。5.4也睡了一天，然后晚上去IBP跟皖豫、佳桢和诗瀚去新奥购物中心吃了牛腩锅。5.5除了划了一下午船也算放假了。然后今天，5.6，早上睡到11点，简单吃了午饭然后去北体上了Yoga团课。前一天晚上hanyi还提醒我不要熬夜记得参加，之前已经鸽了两次了。感觉很好玩。然后又回寝室睡了一觉，醒来已经是下午17点多了。想起来今天的事情还都没开始做。赶紧盘点一下。

    1. 整理湖州比赛的报名信息，找冯老师签字和体育部盖章（这个本来打算今天做，截止日期也是今天，但是现在老师们已经下班了，还是明天弄吧）
    2. 跟老板说了今天要给他看设计的TypeIII CRISPR的方案，打算现在立刻做。
    3. 老板说向ASW dTAG细胞系导入Cas13d的可以开始了，但我还没做基因组和WB验证。
    4. 提SRP9/14的RNA并rRNA depletion建库。
    5. 周三要work report了，我需要在那之前再挖掘L1 RNA pull down和RLIG1-dTAG的质谱数据。

    OK那我现在开始第二项了。老板提到了几个重点问题要逐个回答一下。

    1. 收到质粒，打算做什么
    2. 能否像 cas13d sgRNA系统一样，做个稳转细胞系
    3. 这个质粒中的序列 齐全吗？还需要合成DNA片段，凑齐吗

    还提了几个建议：

    1. 可以选取某个关键orf加上dox
    2. 再在某个orf后面加上 GFP荧光标记指示表达

    可以看出，他并没有一个整体上的实验设计，但是觉得构建稳赚细胞系让它成为一个可用的细胞系是可以马上开始做的事情。所以我需要汇报的点有两个：

    1. 具体的构建细胞系的方案，具体需要
      • 了解Csm1/Cas10, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cas6这几个蛋白分别在其中起到什么作用
      • 在2014Science文章中看看，作者具体的实验流程，用的是什么转染方式。
      • 设计具体的质粒设计
      • 设计具体的稳定细胞系构建流程
    2. 学习crRNA的构建和选择方法，以及能否将crRNA单独用一个质粒表达。
    3. 从整理上，设计接下来要用TypeIII CRISPR系统进行的实验思路和实验设计。

    2024.5.9

    Today’s task

    1. 提质粒、设计测序引物、送测序
    2. 设计TypeIII质粒构建路程和引物
    3. ASW-dTAG加药
    4. 分析RLIG1的APEX2质谱数据
    5. 撰写并提交biweekly work report.

    2024.5.25

    1. 加dox
    2. 提质粒
    3. wt传代
    4. Rip分析
    5. 口语学习
    6. 交阳光体育免修
    7. 朱哥快递
    8. 看文献
    9. 17点出发训练
    10. 晚上九点apex labeling
    11. 学习一带一路国际议题

    2024.5.27

    1. 下午16点在老板办公室跟秦为讨论LINE-1 RNA的新研究方向。
    2. 交阳光体育免修
    3. 朱哥的快递
    4. 交ANKRD11的质谱样品
    5. 去东操跑廊还屁垫和拿小旗子。
    6. 问张朋怎么做的小旗子，如果不回复我就去淘宝买。

    2024.6.6

    最近每天过得跟打仗一样。今天的todolist

    • 下午两点小组会
    • 下午16点圆明园训练，需要提前准备桨和坐垫。安排下午训练桨位
    • 安徽比赛的人今天把救生衣桨坐垫准备好交接
    • 上午去校医院拿体检报告
    • 今天承诺了给老板交博资考答辩的ppt
    • 交ppt前我需要用实验室的服务器分析RIP-seq并画图。

    2024.6.17

    博资考挂了，首高比完了。男第四，女第三。