质粒测序

最近带师弟XYY构质粒，遇到一个问题。一个质粒反向引物测出来是对的，正向引物测出来是错的，后者的序列是没切开的原载体。看起来应该是模板不干净，至少混有两种模板。

这有个可怕的问题，就是如果全部是用正向引物把这个不干净的质粒测通的话，我就认为测序结果正确了。之后就很可能用错误的质粒开始做实验。

给今后实验的指导经验：

测序引物优先选择载体上插入片段上下游各一条通用引物（正向和反向），这样如果质粒不干净，能最大程度上检测到其他序列（或双峰）。
在质粒测序正确后，进行一步平板划线，通过再一次挑单菌落来排除污染。提完质粒再测一条引物来验证。
其实最直接和简单的办法是严格控制第一次转化后平板上的菌落密度，防止挑到多个菌落。但很多时候无法预测菌落密度。我能想到的方法是平板涂布和划线相结合。每次菌液在平板的一半区域混匀，在另一半划线。如果长得少，自然有单菌落，如果长得多，在划线区域也能挑到单菌落。

第二点但是我本科时带我的MRZ师兄也会注意，他每次质粒测序完都会用1mL菌液小提质粒一次，然后再次转化感受态，挑单菌落养到30mL中提质粒一次。后者才拿来做实验。

他这个流程有点过于麻烦。现在LN lab惯用一种小题中量试剂盒，每次摇菌8mL，操作方便得很。在此基础上再多一步划线操作就完美了。