好的，这是从您提供的文件中提取并翻译的HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (R312) 中文版实验流程。
产品描述
HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 是 HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 的升级版，包含新一代逆转录酶 HiScript® III Reverse Transcriptase 及为其优化的 Buffer，进一步提升了第一链合成的效率。试剂盒中的 5 × gDNA wiper Mix 可在2分钟内快速去除基因组DNA污染，使结果更可靠，并简化了qPCR引物设计过程，无需设计跨越外显子-外显子连接的引物。试剂盒包含单组分的逆转录引物 Oligo (dT)20VN 和 Random hexamers，用户可根据需要灵活选择引物用于后续实验。本试剂盒可用于合成全长cDNA（最长可达20 kb）用于克隆等下游实验，也可用于合成高度均一的cDNA用于qPCR。
储存条件
在-30 ~ -15°C下储存，并在≤0°C下运输。
注意：10 × RT Mix 含有高浓度的DTT，在低温下可能会析出。使用前请恢复至室温，轻柔摇晃并充分混匀，待沉淀完全溶解后再使用。
注意事项
- 防止RNase污染
请保持实验区域清洁；佩戴一次性手套和口罩；使用无RNase的耗材，如离心管和移液器吸头。 - 引物选择
- 对于真核生物RNA模板，使用Oligo dT引物与真核mRNA的3′ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
- 基因特异性引物（GSP）具有最高的特异性。如果GSP在第一链cDNA合成中失败，可使用Oligo (dT)20VN或Random hexamers进行逆转录。
- Random hexamers的特异性最低。所有RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA，都可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂的二级结构和高GC含量，或模板是原核来源时，若Oligo (dT)20VN或GSP无法有效引导cDNA合成，可使用Random hexamers作为引物。
- 对于qPCR，建议将Oligo (dT)20VN与Random hexamers按推荐比例混合使用，可使mRNA各区域的cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和可重复性。
- 关于去除基因组
也可以不进行基因组去除步骤直接进行逆转录，空余体积用RNase-free ddH2O补足。
实验流程
◇ 用于 PCR
1. RNA 变性*
在无RNase的离心管中混合以下组分：
| 组分 | 体积/用量 |
|---|---|
| 总RNA 或 Poly A+ RNA | 10 pg – 5 μg 或 10 pg – 500 ng |
| RNase-free ddH₂O | 补至 8 μl |
在 65°C 孵育 5 分钟，然后立即冰浴 2 分钟。
*变性步骤有助于打开二级结构，提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kb的cDNA片段，请不要忽略此变性步骤。
2. 去除基因组DNA
在上述混合物中加入：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 第1步的混合物 | 8 μl |
| 5 × gDNA wiper Mix | 2 μl |
轻柔地上下吹打数次以充分混匀。在 42°C 孵育 2 分钟。
3. 第一链cDNA合成反应液配制
在上述混合物中加入以下组分：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 第2步的混合物 | 10 μl |
| 10 × RT Mix | 2 μl |
| HiScript III Enzyme Mix | 2 μl |
| Oligo (dT)₂₀VN 或 Random hexamers | 1 μl |
| RNase-free ddH₂O | 5 μl |
| 总体系 | 20 μl |
轻柔地上下吹打数次以充分混匀。
▲本产品也适用于使用GSP进行逆转录。为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请将GSP (2 pmol)加入此混合物中。
4. 反应程序
| 温度 | 时间 |
|---|---|
| 25°C | 5 分钟 ᵃ |
| 37°C | 45 分钟 ᵇ |
| 85°C | 5 秒 |
ᵃ. 仅在使用Random hexamers时需要此步骤。使用Oligo (dT)₂₀VN或GSP时请跳过此步骤。
ᵇ. 对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，温度可提高至50°C，这将有助于提高产量。
产物可立即用于PCR，或在-20°C下保存6个月。建议分装后在-70°C长期保存。cDNA应避免反复冻融。
◇ 用于 qPCR
1. 去除基因组DNA
在无RNase的离心管中混合以下组分：
| 组分 | 体积/用量 |
|---|---|
| 总RNA 或 Poly A+ RNA | 10 pg – 1 μg 或 10 pg – 100 ng |
| 5 × gDNA wiper Mix | 2 μl |
| RNase-free ddH₂O | 补至 10 μl |
轻柔地上下吹打数次以充分混匀。在 42°C 孵育 2 分钟。
2. 第一链cDNA合成反应液配制
在上述混合物中加入以下组分：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 第1步的混合物 | 10 μl |
| 10 × RT Mix | 2 μl |
| HiScript III Enzyme Mix | 2 μl |
| Oligo (dT)₂₀VN | 1 μl |
| Random hexamers | 1 μl |
| RNase-free ddH₂O | 4 μl |
| 总体系 | 20 μl |
轻柔地上下吹打数次以充分混匀。
▲本产品也适用于使用GSP进行逆转录。为避免gDNA wiper对GSP的潜在影响，请将GSP (2 pmol)加入此混合物中。
3. 反应程序
| 温度 | 时间 |
|---|---|
| 37°C* | 15 分钟 |
| 85°C | 5 秒 |
*对于具有复杂二级结构或高GC含量的模板，温度可提高至50°C，这将有助于提高产量。
产物可立即用于qPCR，或在-20°C下保存6个月。建议分装后在-70°C长期保存。cDNA应避免反复冻融。