小鼠基因型鉴定
Genotyping
当涉及到不同基因型小鼠的杂交的时候，其后代基因型遵循孟德尔遗传定律和连锁交换定律。我们往往需要其中的一种特定的基因型用于后续实验，这时就需要对小鼠的基因型进行鉴定（Genotyping）。
鉴定的方法是：从少量组织（血液、尾缘、脚趾）中提取基因组，通过在目的位点设计可以对不同基因型进行区分的引物，PCR后通过跑胶条带差异或测序碱基顺序差异确定Genotype。
剪脚趾
剪脚趾有两个目的，一是提取DNA用于genotyping，二是对小鼠进行标号。
剪脚趾的时期一般是小鼠出生后10-15天。因为小鼠在出生后21天断奶，需要和母鼠分笼，而分笼一般是根据实验目的按照基因型分的，所以剪完脚趾这几天正好用于做genotyping，下一次就可以带着genotyping的结果去动物房分笼了。
剪脚趾的操作：右手抓着尾巴，让小鼠在铁网上爬。左手从尾部开始捏住脊柱向前推，直到拇指和食指捏住双耳，手掌固定住小鼠后背部皮肤，翻过来腹侧向上。右手拿剪刀剪脚趾。如果小鼠攥拳，轻微摇晃使其手掌（脚掌）张开。
上图是腹侧向上（小鼠躺着）的简笔画，前爪4指，后爪5趾。标号顺序是，以实验者观察从左到右的视角，从后爪开始，依次为个位数1~9和10，前爪为十位数20~90，这样能表示1~100之间的任意整数. 收集剪下来的脚趾到标号对应标号的EP管里，一趾一管。
实验要求同性别，一般在剪脚趾时处死新生雌鼠，只对新生雄鼠标号。区分雌雄主要看是否有乳头和小鸡鸡。
PCR
基因组提取流程：
在每个脚趾的EP管中加入120μL A液，95℃金属浴10min，离心，上清加入30μL B液，混匀。取1μL作为25μL PCR体系的模板（实验很糙，离心完不用换管子，直接加B液就行）。
A液：50mM NaOH (0.1g→50mL水) B液：1M Tris + 5mM EDTA pH=8.0 (6.06g Tris + 0.093g Na2EDTA·2H2O → 50mL水)
PCR产物跑胶（或测序），条带小的话记得用2% Agarose Gel。
拿到genotyping结果后，在小鼠出生后21天断奶后分笼。出生后6~8周小鼠性成熟，一般用8周鼠进行实验，标配是6只实验鼠+6只对照鼠。
下面举例子：
CKO小鼠genotyping
假设我们已经拿到纯合的flox小鼠和Cre小鼠了。第一步是让这二者杂交，后代F1应为杂合flox和杂合Cre。我们当然需要纯合的敲除鼠，所以F1自交。根据孟德尔遗传定律，F2有1/4的概率得到纯合的flox，有1/4的概率得到纯合的Cre，那么如果是完全自由组合，应该有1/16的概率得到纯合的flox和Cre，这样就实现了floxed gene的两个allele都被敲了。Cre杂合（hemizygous）就可以发挥作用，所以我们有1/4*3/4=3/16的概率得到目的敲除鼠。
因为F1中的Cre是hemizygous，F2中有可能产生Cre的nullizygous，以及floxed gene的heterozygous和nullizygous。这不是我们想要的，所以进行genotyping。
根据实验目的，Genotyping主要看两点：第一，flox要求是纯合的，所以需要把flox allele (CKO allele)和wt allele设计引物进行区分。第二，必须存在Cre酶，homozygous和hemizygous都可以，但不能是nullizygous，所以需要设计引物区分Cre allele和wt’ allele（wt后面加了个’以示跟flox位点的wt区分）。
第一对引物这么设计，红色的是loxp site，有loxp的就长几十个bp，就是CKO allele，短的就是wt allele。
第二对引物测有没有Cre，用3条引物混一块PCR。如果只有<wt Forword和common>这一对的片段，说明是纯合wt’ allele，如果只有<mutant forward和common>这一对的片段，说明是纯合Cre allele，如果两条带都有，说明是hemizygous。
下面是我昨天鉴定的真图。
Cas9KO是直接敲掉了两个碱基，图上看不出差异，需要测序。
这种就说明，确实是KO鼠，发生了Frame shift。CKO中6、7、9号是杂合子，意味着有一条allele是floxed gene，另一条没有带loxP，不能用。Cre中3、4、5、6、8号是杂合子，其余都是纯合子，因为没有遇到nullizygous，所以都能用。
综上，这一批鉴定的老鼠中6、7、9号不是我们想要的，处死。其余等到出生后21天断奶，分笼。
补充
- 存在一种极端情况，floxed gene和Cre如果恰好在一条染色体上，那么就不能只考虑孟德尔遗传了。这两个基因会连锁遗传，重组率跟在染色体上的距离成正比。如果它们恰好挨得特别近，就会出现从F1杂合子自交到F2的过程中杂1万只老鼠也得不到目的小鼠的情况。虽然这种可能性微乎其微，但确实还是不能忽视。Alb是肝脏特异性启动子，查了一下本来是在5号染色体上的，但是公司交给我们的Cre鉴定引物中其它两条都比对在13号染色体上。所以这个Alb-Cre鼠应该是构建时插入到了13号染色体的这个地方。我去genome browser瞅了瞅这个地方是不是空旷的，发现竟然有个基因。
中间上方那个蓝紫色的”YourSeq”是上面wild type Forward和Common这两条引物出现的地方。不知道这个Speer6-ps1会有什么影响，它好像是个假基因。我也不知道，公司做Cre鼠是用同源重组定点插入到这里的，还是随机插入后测序发现只在这里有一个拷贝。 - 杂交后代genotype不符合预期的小鼠也不是就完全没用要处死了，同窝出生的只表达Cre但不含loxP（或只含loxP不表达Cre）的小鼠是最好的对照。当然，一窝生出来的几只老鼠是什么基因型完全看运气，所以这样的对照虽然最好，但往往凑不齐做实验所需的数量，多数时候还是需要专门配种用于做对照的小鼠。
中间上方那个蓝紫色的”YourSeq”是上面wild type Forward和Common这两条引物出现的地方。不知道这个Speer6-ps1会有什么影响，它好像是个假基因。我也不知道，公司做Cre鼠是用同源重组定点插入到这里的，还是随机插入后测序发现只在这里有一个拷贝。推荐阅读
[1] Mouse Modeling, Part 2: Breeding and Crossing Mice (addgene.org)