SRP9/14单克隆的RNA-seq和RIP-seq

2024.5.11

李浩源分析的SRP9和SRP14的RIP-seq初步结果

2024.5.2

上午10点开始片段分选。

PCR index primer: 91~100

回收后子文库浓度：

编号	浓度（ng/μL）	10μg对应体积
1	5.52	1.81
2	4.18	2.39
3	5.76	1.74
4	1.46	6.85
5	0.696	14.37
6	1.26	7.94
7	1.97	5.08
8	2.7	3.70
9	1.87	5.35
10	out of range	混样了全部，大约14μL

2024.5.1

上午10点将醇沉的RNA从-80℃取出，14000rpm 4℃离心20min.

75％乙醇洗一次，用6.5ul水溶解，测浓度（因为这次细胞量只用了2百万，所以用尽可能少的体积溶解，6.5μl是考虑能够做2个3μL的打断）。

编号	样品名	浓度ng/μl	体积μl	补水体积μl
1	0hdTAG-input	109.8	0.98	2.02
2	24hdTAG-input	86.3	1.24	1.76
3	SRP14-0hdTAG-rep1	47.5	2.26	0.74
4	SRP14-0hdTAG-rep2	43.5	2.47	0.53
5	SRP14-24hdTAG-rep1	42.9	2.50	0.50
6	SRP14-24hdTAG-rep2	46.9	2.29	0.71
7	HA-0hdTAG-rep1	54.9	1.95	1.05
8	HA-0hdTAG-rep2	49.1	2.18	0.82
9	HA-24hdTAG-rep1	46.1	2.33	0.67
10	HA-24hdTAG-rep2	51.9	2.07	0.93

建库做到接头连接结束，放4℃过夜。

2024.4.15

上午12点，做SRP14C RIP，用anti-SRP14和anti-HA C29F4两种抗体，每个样品40ul beads+5ul 抗体+2百万细胞

4度binding了6h，在-80℃醇沉。

2024.4.14

11:00 给两天前铺板的SRP14C单克隆加dTAG(5000分之一)

送出去了SRP9的RIP-seq.

序号

样本名称(限定数字、字母、“-”及”_”组成)*

物种*

文库片段大(bp)

数据量单位 (M/G)*

数据量*

Index碱基是否平衡*(包lane必填)

样本保存介质

是否环化*

测序平台*

策略*

浓度(ng/ul)

体积(ul)

是否为备份*

备注

1

4413SRP9-RIP-1

human

300-500bp

G

20

碱基平衡

TE buffer

未环化

DNBSEQ-T7

PE150

1.61

12

正常样本

1

4413SRP9-RIP-2

human

300-500bp

G

20

碱基平衡

TE buffer

未环化

DNBSEQ-T7

PE150

1.61

12

正常样本

拆分样本信息

序号

样本名称(限定数字、字母、“-”及”_”组成)*

子文库名称(限定数字、字母、“-”及”_”组成)*

index编号(限定英文数字)

单（双）index

I7(indexF)-序列                       5′-3’方向*

I5(indexR)-序列                       5′-3’方向*

数据量单位 (M/G)*

数据量*

碱基是否平衡*(插入片段)

文库类型*

接头类型*

文库末端5’磷酸化*

建库试剂盒

备注

1

4413SRP9-RIP-1

0hdTAG-input

UDIPrimer61

双index

TGGTAGCT

CAACACCT

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

2

SRP9-0hdTAG-rep1

UDIPrimer63

双index

GATGTGTG

CATGGCTA

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

3

SRP9-0hdTAG-rep2

UDIPrimer64

双index

GATTGCTC

GTGAAGTG

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

4

SRP9-48hdTAG-rep1

UDIPrimer65

双index

CGCTCTAT

CGTTGCAA

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

5

SRP9-48hdTAG-rep2

UDIPrimer66

双index

TATCGGTC

ATCCGGTA

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

6

4413SRP9-RIP-2

48hdTAG-input

UDIPrimer62

双index

CGCAATCT

ATGCCTGT

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

7

HA-0hdTAG-rep1

UDIPrimer67

双index

AACGTCTG

GCGTCATT

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

8

HA-0hdTAG-rep2

UDIPrimer68

双index

ACGTTCAG

GCACAACT

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

9

HA-48hdTAG-rep1

UDIPrimer69

双index

CAGTCCAA

GATTACCG

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

10

HA-48hdTAG-rep2

UDIPrimer70

双index

TTGCAGAC

ACCACGAT

G

4

碱基平衡

mRNA链特异性文库

TruSeq library（双index文库）

5’未磷酸化

2024.4.12

又重新铺了SRP14C的板。还是前面的4个单克隆，这次打算加药24h做实验。

2024.4.11

重新铺板的SRP14C又不能做RNA-seq和RIP-seq了，因为发现dTAG处理48h后，除了44号克隆，其他的都不贴壁。

2024.4.10

22:00左右观察SRP14单克隆，发现已经长得爆满了，赶紧传代。加药的继续加药，不加药的继续不加药。

SRP9的RIP-seq建库做到末端修复完成了。在4℃放着等4月12号继续做。

2024.4.9

18:00给SRP14单克隆加dTAG。

2024.4.7

19:00查看SRP9和SRP14单克隆。发现部分细胞死亡。

不加药板1：SRP14C-54#死亡

不加药板2：SRP14C-54#死亡

加dTAG 48h板1：SRP14C-37,42,54,55死亡

加dTAG 48h板2：SRP9C-34, SRP14C-37, 42, 44, 54, 55死亡

RNA-seq做了SRP9C-5,9,22,28,34和SRP14C-44的。12-well孔中弃掉培养基直接加300μL TRIzol Reagent，收集到-20℃暂存。

RIP-seq做了SRP9C-5,9,22,28混。

SRP14-37,42,44,55重新铺板（每个12-well孔0.2million细胞），准备重新做RIP-seq和RNA-seq.

每个样品都是40μL Dyna ProteinG beads，用5μl anti-SRP9(proteinTech)或anti-HA(CST, C29F4)。每个样品4百万细胞。

SRP9C no-dTAG	SRP9C +dTAG 48h
input 3μl	input 3μl
anti-SRP9 replicate1	anti-SRP9 replicate1
anti-SRP9 replicate2(beads抗体只包了30min）	anti-SRP9 replicate2 (beads抗体只包了30min)
anti-HA replicate1	anti-HA replicate1
anti-HA replicate2	anti-HA replicate2

4℃ binding 23:00~3:00 (4h）

2024.4.5

18:00加药dTAG，稀释5000倍。之后48h没有换液，也没有在显微镜下观察。

2024.4.2

复苏到12孔板：SRP9C-5,9,22,28,34; SRP14C-37,42,44,54,55，都是NCCIT中的dTAG单克隆。

打算做RIP和RNA-seq，RIP可以5个单克隆混起来变成一个样品做，RNA-seq要单独做。