ANKRD11的APEX2 labeling

2024.5.13

邮件收到了质谱结果，秀峰分析了，说结果还不错拉到了一些包括CTCF在内的已经被报道过的跟ANKRD11互作的蛋白。老板让重复一下。

2024.4.23

上午去u5-028送了样

(对于每个replicate，200ng投入蛋白的全部elute用于DIA质谱，
跑胶（考染和Strep-WB）上样量为打质谱的1/4.)

2024.4.21

单位：μg/μl1st取了1μL蛋白测浓度2nd取了2μL蛋白测浓度两次平均值
V5 rep10.372683*20=7.450.973557*10=9.748.60
V5 rep20.214166*20=4.280.766011*10=7.665.97
ANK rep10.553327*20=11.071.071755*10=10.7210.90
ANK rep20.628808*20=12.580.880540*10=8.8110.70

取240μL Streptavidin beads (C1)，RIPA洗2次。每样品60μL beads，加300μg蛋白，用RIPA (+cocktail +PMSF)补全体积至200μL，4℃旋转结合，5:45开始，22:45结束（共17h）。

200μL RIPA洗2次。1M KCl洗一次(4℃旋转3min），0.1Na2CO3洗一次（4℃旋转3min），2M Urea in 10mM Tris-HCl, pH8.0 洗一次（4℃旋转3min），RIPA洗2次。都加cocktail。加入45μL洗脱液(3x protein loading buffer supplemented with 20mM DTT and 2mM biotin)，95℃煮5min。室温12000rpm离心10min。

用4~20% 15-well胶

Gel1（打质谱，考染）: Marker(plus), null, V5-rep1-elute (30μL), null, V5-rep2-elute (30μL), null, ANK-rep1-elute (30μL), null, ANK-rep2-elute (30μL), null, Marker

Gel2（Strep-WB）: Marker(plus), V5-rep1-input(20μg), V5-rep1-elute (7.5μL), V5-rep2-input(20μg), V5-rep2-elute (7.5μL), ANK-rep1-input(20μg), ANK-rep1-elute (7.5μL), ANK-rep2-input(20μg), ANK-rep2-elute (7.5μL), Marker

Gel3（跟Gel2相同，考染）: Marker(plus), V5-rep1-input(20μg), V5-rep1-elute (7.5μL,不太够,缺大约2.5μL), V5-rep2-input(20μg), V5-rep2-elute (7.5μL), ANK-rep1-input(20μg), ANK-rep1-elute (7.5μL), ANK-rep2-input(20μg), ANK-rep2-elute (7.5μL), Marker


2024.4.15

12点做了labeling，液氮速冻到-80摄氏度

2024.4.14

11:00 加万分之一dox

2024.4.12

实验组和对照组各铺了2个孔的6-well，每个孔0.6百万细胞。打算APEX2-V5用万分之一dox诱导24h后做labeling.

2024.4.10

张涛用我构建好的ANKRD11-N-APEX2-V5-pGEMT质粒，knock-In了NCCIT细胞并鉴定成功。

晚上，从张涛那里拿到了ANKRD11-N-APEX2-V5-pGEMT的NCCIT冻存细胞，复苏到6-well plate了，同时从我的液氮罐里拿出了TetOn-APEX2-V5 (NCCIT细胞系)，复苏到6-well plate了。

2024.3.19

张涛说不要P2A的质粒了，直接用PB-tetOn-APEX2-V5-BSD那个当对照。

2024.3.13

查看测序结果，不带P2A的noP-Bac1在ANKRD11-right上有一个点突变，但看张涛发的dTAG的质粒里有两个克隆的测序，其中1个也有这个突变，可能他给我的dTAG质粒就是那个带突变的，看了noP-Bac2,3也有这个突变。那这样noP-Bac1就对了。

带P2A的Bac1在P2A处开始出现双峰。Bac4和Bac5有明显错误，APEX2中间有插入等。

困得不行了，明天debug吧，总之带P2A的没构建出来。

2024.3.11

4:00 菌P结果正确：

不带P2A的送测Bac1,2,3；带P2A的送测Bac1,4,5.

Frag ae, Frag ef:

Frag (ae+f), Frag (a+ef)：

可以看到Frag(a+ef)这个构建路线得到了正确大小的条带。但隐约感觉有个很相近的杂带。

的确，双酶切之后跑胶发现确实有两条带（右）：

切取了相对小的那条带。

2024.3.10

4:00连接涂板。

2024.3.8

从左到右：片段a,b,c,e,f,A（片段A是构建C-ASW-dTAG时用NcoI新引物PCR的）：

片段d,g：

可以看到片段g过小，重新PCR了一次片段d和g，先不加引物PCR6个cycle(63到58touchdown)，然后加引物PCR（63-58touchdown）

结果带型还是一样的，可能三段一起PCR引起的问题：

打算先做a+e,产物ae再和f融合PCR，同时先做e+f，a和产物ef融合PCR.

先做a+e,产物ae再和f融合PCR:

  1. a和e为模板，4307EcoRI-F和4307P2A-V5-R为引物，融合PCR得到1771bp产物ae.
  2. ae和f为模板，4307EcoRI-F和4307NotI-R为引物，融合PCR得到2901bp产物aef.

先做e+f，a和产物ef融合PCR:

  1. e和f为模板，4307APEX2-F和4307NotI-R为引物，融合PCR得到1975bp产物ef.
  2. a和ef为模板，4307EcoRI-F和4307NotI-R为引物，融合PCR得到2901bp产物aef.

2024.3.7

帮张涛构建的。

需要构建2个：

  • ANKRD11-N-APEX2-V5-pGEMT
  • ANKRD11-N-APEX2-V5-P2A-pGEMT

设计引物

ANKRD11-N-APEX2-V5-pGEMT构建路线：

  1. 以pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒为模板，4307EcoRI-F和4307HA-R为引物，PCR得到946bp片段a
  2. 以APEX2-V5-RLIG1质粒为模板，4307APEX2-F和4307V5-R为引物，PCR得到809bp片段b
  3. 以pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒为模板，以4307Linker-F和4307NotI-R为引物，PCR得到1125bp片段c
  4. 以片段a,b,c为模板，4307EcoRI-F和4307NotI-R为引物，融合PCR得到2844bp片段d
  5. EcoRI和NotI双酶切片段d
  6. EcoRI和NotI双酶切pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒，回收3968bp条带（大）。
  7. 步骤5,6的产物用T4连接，转化
  8. 鉴定引物：4307ANK-bacF, 4307ANK-bacR，正确大小为1000bp
  9. 测序引物：4307ANKseqF1,2,3,4

ANKRD11-N-APEX2-V5-P2A-pGEMT构建路线：

  1. (已取得)以pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒为模板，4307EcoRI-F和4307HA-R为引物，PCR得到946bp片段a
  2. 以APEX2-V5-RLIG1质粒为模板，4307APEX2-F和4307P2A-V5-R为引物，PCR得到845bp片段e
  3. 以pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒为模板，以4307P2A-Linker-F和4307NotI-R为引物，PCR得到1149bp片段f
  4. 以片段a,e,f为模板，4307EcoRI-F和4307NotI-R为引物，融合PCR得到2901bp片段g
  5. EcoRI和NotI双酶切片段g
  6. (已取得)EcoRI和NotI双酶切pGEMT-N-ANKRD11-dTAG质粒，回收3968bp条带（大）。
  7. 步骤5,6的产物用T4连接，转化
  8. 鉴定引物：4307ANK-bacF, 4307ANK-bacR，正确大小为1000bp
  9. 测序引物：4307ANKseqF1,2,3,4