Co-IP实验细节

看了丁香园的一个直播视频，主讲是ThermoFisher公司的一个老师，做一点笔记。

一些需要格外注意的点：

1. 阳性对照是上柱子前的Input，即全细胞或组织裂解液，目的是：
   1. 确认目的蛋白正常表达
   2. WB抗体可以成功检测到目的条带
   3. 确认目的条带位置
2. 阴性对照是与IP抗体同种属的Normal IgG，目的是排除非特异性条带的干扰。
3. 抗体的选择不同于普通WB，普通WB是识别变性后的线性多肽的，而Co-IP要求检测细胞生理状态下蛋白和蛋白之间天然的相互作用，因此，能做WB的抗体不一定能做IP，在选择抗体时，注意看是否抗体公司的官网上是否标记了“经过IP验证”。最好还经过了“靶标特异性确认”（即Knockout确认）。
4. 同上一条的原因，做Co-IP时裂解液的选择很重要，使用非变性温和裂解液，以免破坏蛋白-蛋白相互作用。
   1. 避免使用离子型去垢剂（如SDS），蛋白变性，破坏蛋白-蛋白相互作用
   2. 使用温和非离子型去垢剂（如NP-40, Triton X-100等）
   3. 生理离子浓度（如150 mM NaCl）
   4. 尽量避免剧烈超声和涡旋处理
5. 对于磷酸化蛋白，除了添加蛋白酶抑制剂外还要添加磷酸酶抑制剂。
6. 如果未富集到目的蛋白，可能是因为抗体在介质上固定不牢的原因。
   1. Protein A和Protein G对不同种类的抗体结合能力有差异，Protein A/G兼具Protein A, G的结合位点。
   2. MRZ师兄遇到过Binding Buffer中NaCl浓度过高导致IP蛋白结合不到抗体上的问题，降低NaCl浓度后就可以了。
7. IP一抗的轻重链可能会被WB二抗检测到，如果跟待检测的目的大小正好撞车会很尴尬，设计实验时最好提前考虑到这个问题，选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗。