2024组会
2024.5.12 RNAdamageRepair
老板说，CRISPR-Csm的质粒构建出来后，把T2A-GFP换成T2A-RFP，因为GFP要在之后的CRISPR Screen的reporter中使用。
另外，向ASW-dTAG细胞系中构建Cas13d切割系统时，因为dTAG细胞系已经有GFP了，所以可以不用PB-TetOn-Cas13d-T2A-GFP这个质粒，杨乐有PB-TetOn-Cas13d-T2A-tagBFP的质粒。
然后再催一下质谱平台的ANKRD11的DIA质谱结果。
RLIG1的质谱老板看样子不在意了，可以摆了。
2024.4.30 RNAdamageRepair
同时切割L1和U2, 同时切割L1和U6，加dox诱导Cas13d，加dTAG降解RTCB，看unmapped reads变化。
做U2和U6是因为之前在chimeric DNA中发现U2和U6在所有snRNA中出现最多。
检查一下RTCB的RIP-seq数据（切割前后）中有没有snRNA的富集。
给杨乐布置了一堆任务（U2,U3,U6都做），说他忙不过来找我帮忙。
现在实验室的三代测序在百迈客公司，都是直接把DNA送过去。
然后老板讲了一下文章的outline
标题暂定为：Selective ligation of broken RNAs preserves RNA homeostasis
看一下我的LINE-1 APEX2质谱结果里有没有RTCB, ASW，找找它们别的名字。
让我在addgene上订购the type III CRISPR-guided endonuclease plasmids, 参考2024年的Science文章。
老板说尽快，因为这篇Science出来之后很多组应该都会去做。
在ASW-dTAG细胞系中导入切割体系（稳转Cas13d, sgRNA），然后再dTAG了ASW后用anti-RTCB(内源抗体)做RTCB的RIP-seq。如果ASW降解后RTCB不结合LINE-1了，说明RTCB与LINE-1的结合依赖于ASW。
看RLIG1的质谱结果的genelist，逐个看基因名字。RLIG1的质谱要重新做一遍。
还让仔细分析LINE-1的质谱数据。
2024.3.27 RNAdamageRepair
RNA seq一般不能call peak，RIP-seq不打断RNA理论上也不能call peak
在mESC做内源ASW的RIP-seq，发现U3富集FC>2.
老板让搞一个高分辨率的RIP-seq protocol（打断reads）
洪剑涛实验室的T-RIP-seq
mouse ASW在正常条件下（不切割LINE-1 RNA）就结合年轻的L1MdA。
人的RTCB分布核、质都有，主要在质。
看一下老鼠RTCB的IF
mESC中ASW加dTAG后做RNA seq，一些LINE-1 RNA的表达增加了。
老板让我做SRP9/14单克隆的内源水平的RIP-seq
2024.3.20 RNAdamageRepair
找L1-repeats chimera
找L1附近的repeats，最多的是L1和Alu直接毗邻的，全基因组中有事30万个L1-Alu chimera
这些L1的特点：old, 大部分5utr是不完整的，长度也非常短（100bp左右），一多半chimera是同向的，一小半是反向的。
30万中有19万是sandwich,即5’L1-Alu-3’L1
2024.3.12 RNAdamageRepair
RLIG1 Cas9 KO加维生素K处理的RNA seq
维生素K处理导致rRNA占比升高，（导致）duplicated reads增加。
Hiseq2由于软件本身原因导致同一批数据两次跑程序之间的mapped和unmapped reads数量不同。
2024.2.28 周总结
老板说可以帮张咏妍处理SRP9/14的单克隆验证，张涛的老鼠。
老板说严小涵的APEX2标记可以和L1-MS一起做。
可以用去年交给杨乐的RNA adapter做Ecoli RTCB 5’OH-RNA sequencing
2024.2.18 周总结
- 要开始准备博资考了，还有一个多月。
- ASW-dTAG验证
- L1 5UTR MS2 RIP-qPCR分析
- L1 5UTR 和 Full length L1 MS2的APEX2 labeling和DIA-MS
- RTCB APEX2 DIA-MS结果分析
- APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2细胞系的构建
- Ecoli RTCB-based 5′-OH RNA seq老板让开始做了
周二鉴定dTAG 整理RTCB结果 分析RIP数据
周三查看RLIG1测序结果 复苏MS2细胞
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