RLIG1的临近蛋白标记

2024-1-31 构建质粒

需要构建两个质粒

• PB-tetOn-APEX2-V5-RLIG1-BSD
• PB-tetOn-RLIG1-V5-APEX2-BSD

这两个质粒以杨乐之前构建过的PB-TetOn-APEX2-V5-RTCB-BSD为模板出发，前者就是将RTCB替换成RLIG1，后者麻烦一点，把APEX2-V5-linker-RTCB替换成RLIG1-linker-V5-APEX2，需要把这几个片段单独PCR出来，再交换顺序连接起来。

该质粒系统含有BSD抗性基因，需要使用blasticidin杀细胞来筛选稳转细胞。还有一个更好的方案是用之前的PB-tetOn-GFP-T2A-HA-POI质粒，含有GFP可以直接FACS分选，不过我的引物已经按照杨乐的质粒设计好了，所以就用这个没有荧光的BSD质粒吧。实际用的模板质粒来自张涛的盒子，克隆序号是10.

2024-1-31 23:46

开始PCR片段1、片段3、片段7.

因为上次用Phanta酶PCR构建出来的其他的克隆有很多突变，我想可能是因为我冰箱里的这一管phanta用了太久了保真度下降了（已经分装减少冻融次数了），这次打算用新的phanta，公共冰箱看了一下没货了，新的phanta还没到，所以用了冰箱里很久没用过的Flash Phanta，3个PCR反应全部56℃退火，20秒延伸，30个循环。

重新转化PB-TetOn-APEX2-V5-RTCB-BSD质粒

只从张涛那里取了2μL（1900ng/μl），因为之后还要酶切载体，所以重新转化提质粒，稀释到10ng/μL浓度，加1μL到100μL DH5α，冰上10min，42℃ 1min，冰上2min，取2μL涂Amp抗性LB板。

在1%琼脂糖凝胶跑胶

从左到右：片段1、3、7，大小均符合预期。

可以看到片段1有两条带，我计划两个方案：

1. 胶回收这两条带（一起回收，因为切胶分不开），以其为模板继续进行下一步PCR，然后将PCP产物测序（不在这一步就测序是因为肉眼可见的回收后浓度低）
2. 明天找杨乐要含有RLIG1 cds的质粒重新PCR

这两个方案同步进行。

2024-02-01 2:35 开始PCR片段2、5、8

模板投入大概10~20ng，酶用Flash Phanta，56℃退火，延伸20s

跑胶：

从左到右：片段2、5、8，大小跟预期差不多。值得注意的是以双条带的片段1为模板PCR得到的片段2只有一条带，说明片段1的两条带可能是在RLIG1 3’UTR处有差异，而CDS是相同的（这样最好了，但该测序还是测一下）

2024-02-01 5:00 开始PCR片段4和片段6

使用Flash Phanta酶，56℃退火，30s延伸。

大小基本符合预期，感觉有点偏小，但不能实锤。融胶后，放冰上等片段9切胶完了一起回收。

2024-02-01 6:40 开始PCR片段9（我真蠢，片段9可以和上一步一起PCR的，白白多耽误两个多小时）

用Flash Phanta酶，56℃退火，20s延伸，模板投入量约25ng.

2024-02-01 8:40左右 开始PCR片段10，模板投入大概60ng，用Flash Phanta酶，56℃退火，30s延伸。

可以看到跑得很丑，而且有杂带，切胶回收了最底下那条，跟预期大小最接近（1823bp）

2024-02-01 14:40

昨晚转化的PB-TetOn-APEX2-V5-RTCB-BSD细菌长起来了，挑了两个菌落，接种8.5mL Amp+ LB培养。

2024-02-02 7:00从摇床取出

按原计划对片段4和片段10进行测序，直接找睿博合成引物并测序。

片段4测序引物：4201RLIG1-seqF、4130RLIG1-seqR2、4130RLIG-seqR1

片段10测序引物：4130RLIG1-seqR2、4131APEX2-F1、4130RLIG1-seqR4

2024年2月16日

查看片段4和片段10的测序结果，发现RLIG1 cds的靠近5’端有一小段存在双峰，从双峰区域两侧依稀可以判断出含有可能正确的一个峰，所以继续进行酶切、连接、转化。但根据双峰易错区域重新设计PCR鉴定引物。

新设计了4216RLIG1-bacR: gaattgcactgtatatatctgcatctaatgcc

与4130RLIG1-bacF一起鉴定，APEX2-V5-RLIG1的正确大小为约200bp，RLIG1-V5-APEX2的正确大小为约1Kb

2024.2.16 18:40 用Thermo的FastDigest快切酶双酶切载体(1ug)、片段4(1ug)、片段10(0.38ug,几乎是全部产物都切了)，37℃, 20min.

酶切产物胶回收，发现片段4和片段10的条带不紧凑，说明还是不单一，跟测序结果一致，并且稍微较大的条带含量高一点，于是去看了双峰区域，发现测序结果和预期RLIG1序列相比，少了101bp，多了102bp，无法通过这个判断是不是预期正确的那个带含量高。

用2X Rapid Ligation Buffer和Rapid T4 Ligase连接片段(25ng)和载体(50ng)，10ul体系，5ul Buffer, 1ul T4 ligase.

molar ratio: 片段 : 载体 = 2 : 1

22℃反应15min，取5ul连接产物，转化50ul Stbl3. 取10ul涂板

2024.2.17 15:00

两个平板各挑取24个菌落，用于PCR鉴定。（新设计的4216RLIG1-bacR没到，忘记邮件发订单了我真蠢，用4130RLIG1-bacF和4130RLIG1-seqR3先鉴定，理论值都是2kb）

上边一排是C-bac1~24，下边一排是N-bac1~24，可以看出条带大小参差不齐，但都在2KB附近，这是跑了1个小时的胶图，还是分不太开。

2024.2.19用新引物（4130RLIG1-bacF和4216RLIG1-bacR）重新鉴定，C端和N端的正确大小应该分别为~200bp和~1000bp

上边一排是C-bac1~24，下边一排是N-bac1~24，各挑三个测序。

N-bac2,3,4用4130RLIG-seqR1, 4130RLIG1-seqR2, 4130RLIG1-seqR3测序。

C-bac1,2,4用4130RLIG1-seqR2, 4130RLIG1-seqR4, 4130RLIG1-seqR3测序。

2024.2.20

查看测序结果

N-RLIG1-Bac2: 前面APEX2-V5到RLIG1的N端都没问题（除了RLIG1有一个同义突变），但是后半段4130RLIG1-seqR3测序有双峰后边匹配不上了，可以换个引物重新测一下RLIG1的C端。

！找到双峰原因了，4130RLIG1-seqR3这条引物在SV40polyA上，而这个质粒上有两个SV40polyA，必然是双峰啊。这么看应该构建成功了，就是测序引物的问题。

N-RLIG1-Bac3: 有一个引物还没测出来，其他也是上面双峰的问题。

N-RLIG1-Bac4: 也是双峰的问题。

C-RLIG1-Bac1: 首先也是4130RLIG1-seqR3这条引物设计错误导致最后的APEX2下半段没测到，其次在V5tag前边的GSG-linker区域出现了7bp的不连续缺失，这个菌不能用。

C-RLIG1-Bac2: RLIG1有一个G→E的突变，GSG-linker有19bp连续缺失，这个菌不能用。

C-RLIG1-Bac4: GSG-Linker是对的，但是APEX2开头有个单碱基缺失，这个菌不能用。

根据以上测序结果，用引物4201RLIG1-seqF继续对N-RLIG1-Bac2,3,4测序，用4131APEX2-F1, 4130RLIG1-seqR2, 4130RLIG1-seqR4三条引物对C-RLIG1-Bac5,6,8,9,10,13,15,16,17,18,19测序。

2024.2.22

查看测序结果

N-RLIG1-Bac2正确

N-RLIG1-Bac3有一个错义突变

N-RLIG1-Bac4存在双峰。

综上，保留N-RLIG1-Bac2，构建成功。

C-RLIG1测的菌比较多，只看了C-RLIG1-Bac6和Bac9是对的，保留C-RLIG1-Bac9，构建成功。

2024.2.22 20:00开始摇菌(8.5mL)

2024.2.28

对提出来的质粒进行跑胶，验证双螺旋比例。

看起来双螺旋比例很高，之后醇沉。（补水到100μL，加10μL 3M NaAc，加300μL无水乙醇，放-80℃醇沉。）

复苏1号盒子的21位细胞（WT NCCIT）于6-well plate.

2024.3.1晚上铺了6-well plate打算转染，但是3.3去看的时候已经完全长满了。打算再传一代。

也可以现在就硬转染，但是细胞太密可能会影响效率，为了不耽误以后更多的时间，还是再传一代吧。

确认了一下BSD抗性基因是组成型表达的，所以筛选前不需要加dox诱导TetOn启动子。但是之后构建好了细胞系应该用anti-V5抗体验证一下➕dox前后。

2024.3.4 19:00做了转染

在6-well plate，每个孔用286ul opti-MEM，加了1.5ug puggybac质粒(2024.1.23提)和1.5ugPB-tetOn-APEX2-V5-RLIG1-BSD或 PB-tetOn-RLIG1-V5-APEX2-BSD质粒。混匀后每个管子加9ul Viafect。混匀，室温静置21min，加入培养中的细胞。因为细胞昨天下午才传，没有换培养基。打算明天换培养基，后天换加blast的培养基。

2024.3.6

问了一下光老师，原来加药一般就是转染后24h，不是48h，刚好看了一下细胞已经长满了，所以顺势传代到加了2μg/mL的Blasticidin培养基中（按实验室储液稀释5000倍）。

2024.3.7 22:00观察细胞状态，发现实验组和WT对照细胞都大部分不能贴壁，而且不能肉眼分辨出实验组和对照之间的区别。

这个现象有两种解释：

1. 对消化后的细胞来说，直接用含有2μg/mL的培养基有点过激了。下次可以用1μg/mL的
2. 转染又失败了，效率过低。或者质粒本身有问题，BSD抗性基因没用。

2024.3.8 18:00 再次观察细胞状态，WT感觉死光了。APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2在密密麻麻的悬浮死细胞下隐约能看到贴壁生长的细胞。用PBS在培养皿中洗了一遍。发现WT99%死光了，没有任何贴壁细胞。而APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2中贴壁细胞剩下很多，甚至可以传代了。这说明实验非常成功。我重新加了2μg/mL的BSD培养基来确保药杀干净。

可以复用的实验条件：对于NCCIT细胞，第一天转染，24h后消化细胞，直接传代到2μ/mL BSD的1640培养基中，杀两天基本就杀光WT了。

计划晚上直接传代，传代时留出一点细胞用来做anti-V5的Western blot，传代后的细胞一部分用于冻存，一部分直接做APEX2 labeling了。

2024.3.10 0:30距离上面的时间过去一天多了。由于个人安排原因没有按计划传代。现在检查细胞状态时，发现WT早已死光。而APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2并没有如预期那般长满，反而可能由于BSD处理还继续有部分死亡，相比之下，RLIG1-APEX2的细胞数量更多。所以将APEX2-RLIG1传代到新的1个6-well plate孔（不加药），将RLIG1-APEX2消化后取1/2传代到1个新的6-well plate孔（不加药），剩下的提蛋白跑WB。

收集的细胞离心弃上清，加30μL WB lysis buffer，加0.3 μl Cocktail Protease inhibitor和0.3 μL PMSF，冰上静置裂解20min，14000rpm 4℃离心10min，收集40μL上清到PCR管，加8μL 6xSDS loading buffer，98℃煮5min。用15well 4%~12%，marker用的PLUS的。上样顺序：

Maker(5μL), Ctrl(15μL), RLIG1-V5-APEX2(20μL), Maker(5μL), Ctrl(15μL), RLIG1-V5-APEX2(20μL), Maker(5μL)

RLIG1-V5-APEX2 66.7KD
ACTB 42KD

2024.3.10 4:30开始4℃孵育一抗，anti-V5(AE017)，一抗到22:00开始洗膜。

2024.3.11 4:00 WB结果：

感觉条带太乱，等APEX2-V5-RLIG1提了蛋白，重新换抗体做，还有一个rabbit的anti-V5，这次用的是Mouse的。另外感觉这次anti-V5和anti-ACTB可能交叉污染了。下次重新anti-ACTB也重新配。

2024.3.18我发现这次的WB难看是因为没有加dox，所以V5根本就没表达啊。

2024.3.13 2:00 两个细胞都1传3到6-well plate，准备冻存。

2024.3.19上面说的各冻存了4管，然后剩下的一个孔1传2，跟APEX2-V5对照一起加了dox打算做labeling，打算dox诱导24h，但是因为没起床，36h去看的时候细胞太密了不适合做实验了。所以又传代了一次，还是各2孔。准备明天加dox然后做Labeling。

2024.3.19

下午看WB结果的时候条件都很浅。然后anti-V5好像只砸出来APEX2-V5，没有APEX2-V5-RLIG1和RLIG1-V5-APEX2. 

查了APEX2-V5 28.4kDa, APEX2-V5-RLIG1 66.7kDa, RLIG1-V5-APEX2 66.7kDa.

2024.3.21

下午18:30对APEX2-RLIG1的3个细胞系加了万分之一dox，每个细胞系两个6-well孔，计划24h后做APEX2 labeling。

2024.3.22

把APEX2-RLIG1和RLIG1-APEX2的标记给做了。还是带上APEX2-V5做对照，dox万分之一诱导24h，每个细胞系2个6-well孔，过氧化氢1mM孵育1min后终止（不过我实际操作时注意到，等到加终止剂其实已经快1.5min了），细胞pellet液氮速冻后存在-80℃了，没有继续往下做，因为目前这两个细胞系还未通过WB鉴定（anti-V5砸不到带）

2024.3.27

用RLIG1抗体和V5抗体（都是rabbit）跑了APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2的WB，用的蛋白还是上次冻在-20的。APEX2-V5的不够了，理论上30μg应该上样4.9μL，但是实际上只上样了3.5μL。

2024.3.29

重新做的用anti-V5 (rabbit)和anti-RLIG1(rabbit)的RLIG1的WB结果出来了，两种抗体都能检测到正常大小的条带。之前没有砸出来可能是实验失误没有上样到胶孔里？

2024.4.1

重新配置了RIPA buffer。

水	38mL
1M Tris (pH7.5)	2.5mL
5M NaCl	1.5mL
10%SDS	0.5mL
10%脱氧胆酸钠	2.5mL
10% Triton X-100	5mL

50mL RIPA buffer

从-80℃冰箱取出22日标记的APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2细胞（各2管），加入55μL RIPA (+cocktail +PMSF)，4℃旋转30min裂解细胞，14000rpm离心15min（这里出现了失误，离心机温度设置错了，应该是4℃，实际是25℃）。保留上清。

测蛋白浓度：

V5 rep1	6.73ug/ul
V5 rep2	21.04ug/ul
APEX2-RLIG1 rep1	5.51ug/ul
APEX2-RLIG1 rep2	5.85ug/ul
RLIG1-APEX2 rep1	5.63ug/ul
RLIG1-APEX2 rep2	7.66ug/ul

BradFord测的，两次标准品的A595不一样， 用了第二次的，费解

计划和上周做L1-MS2的实验一样，每个tube里取两份200ug蛋白出来，分别与40ul MyOne Streptavidin beads孵育来着，但是计算了一下这次的浓度不够每个tube 400μg蛋白，所以每个管中取出了300μg蛋白，加60μL beads孵育。打算打质谱还是用200μg蛋白，但是跑考染和Strep-WB的上样减半。

19点开始在4℃旋转孵育。

2024.4.3

3:00取出在4℃旋转的APEX2-V5, APEX2-V5-RLIG1, RLIG1-V5-APEX2.共6个tube，（一共binding了32h）。收集Flowthrough。

200μL RIPA buffer洗两次.

200μL 1M KCl溶液洗一次.

200μL 0.1M Na2CO3溶液洗一次.

200μL (2M尿素 in 10mM Tris-HCl, pH8.0)洗一次.

200μL RIPA Buffer洗两次.

30μL  (3x protein loading buffer supplemented with 20mM DTT and 2mM biotin)洗脱，95℃煮5min。

用了3块4~20% 15-well蛋白胶。

第一块做考染：Marker(plus), APEX2-V5 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), APEX2-V5-RLIG1 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), RLIG1-V5-APEX2 rep1(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), Marker

第二块做Strep-WB: Marker(plus), APEX2-V5 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), APEX2-V5-RLIG1 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), RLIG1-V5-APEX2 rep2(input 20μg, FL18.75μL, Elute 10μL), Marker

SE068 Strep-HRP 1:2K

第三块考染、打质谱DIA-MS: Marker(plus), APEX2-V5 Elute 20μL(rep1, rep2), APEX2-V5-RLIG1 Elute 20μL(rep1, rep2), RLIG1-V5-APEX2 Elute 20μL(rep1, rep2), Marker

下午送了质谱。

2024.4.9

收到邮件

2024.4.20

测试费充值后已经重新提交了申请，并且收到了结果。孙雪妍给我两份代码，老板让我自己分析自己的质谱数据。