警惕虚假完美主义
最近发生了几件事情。
第一，细胞转染失败事件。
第二，质粒醇沉操作失误事件。
第三，一种必须及时遏制的思想。
细胞转染失败事件
为了在NCCIT细胞中构建AXXXX蛋白的KO和KD细胞系（分别采用Cas9 和Cas13d），我在2022年10月24日和师兄一起转染了细胞，其中Cas9蛋白和相应的3条sgRNA在同一个质粒上，因为是敲除，只要一次切断双链并末端修复就可以了，所以只需要瞬时转染。Cas13d和相应的sgRNA也在一个质粒上，但由于是靶向mRNA的KD，所以需要与piggybac质粒一起转染整合入基因组，同时为了防止一条sgRNA不起作用，一共设计了8条sgRNA，每两条同时和piggybac转入同一孔细胞。在dox诱导下，cas13表达，同时T2A连着的EGFP也表达。Cas9则是不需要诱导，瞬转之后直接就会发GFP，所以方案是，在转染60h后，给KD组加dox，这样再过12h，用流式细胞仪分选有绿色荧光信号的阳性细胞。所以10月27日这天上午，师兄带我去做分选。但是，所有细胞都不亮（大概0.1~0.8%的阳性率），包括两个阳性对照也没有。师兄说之前的经验判断构建这两个克隆成功率很高，所以他就没有在荧光显微镜下看荧光。10月29日，我们又转染了一次，这次把cas13的质粒转染量翻了一倍。10月30日在镜下观察时已经发光。因为之前的阳性对照不亮，所以我理所应当的判断是否是转染步骤的问题。我回忆当初的转染步骤，唯一可能出错且最可能的情况就是，转染时没有加转染试剂（Neofect）。所以，这次转染时专门加了一个没有加Neofect的阴性对照，它自然不亮。现在看来，几乎“我忘记加Neofect时唯一可能的错误原因了”，但我实在是一丁点儿自己犯这个错误的印象都没有。
质粒醇沉操作失误事件
正常的醇沉步骤，计算质粒的体积，加入1/10体积3M NaAc，混匀，加入2.7倍体积预冷无水乙醇，混匀，-20过夜后离心，75%乙醇清洗后重悬。我犯了一个很低级的错误。提前在本子上计算了需要加的试剂的量，第一行写了NaAc的体积，第二行写了无水乙醇的体积。结果按照无水乙醇的体积去加NaAc了。我加完急忙补水，但可以想见，不管怎么操作，我心里还是会不放心，所以只能重新摇菌提质粒。
一种必须遏制的思想
一种必须及时遏制的思想——虚假的完美主义。也许是听过太多经过刻意美化的故事，我有时会采取一些除了感动自己之外毫无用处的行为。比如这次的质粒醇沉事件，首先，加错试剂自然是个需要单独讨论的事件，但醇沉步骤本身对于我这次的实验而言并不是必须的。我重现自己的潜意识，是觉得要把实验做成艺术，要优雅，要精确。就像纪录片里说的“高铁轨道允许的误差是1 cm，但某工程师回答记者的采访时说为了体现大国水平就是要控制在1 mm”。乍一听仿佛是一种情怀，实际上完全是脱了裤子放屁。今天我不醇沉也不会出这个错误，导致白白浪费那么多的时间。把实验做成艺术，没有必要在已知不会影响实验结果的方面做到所谓的精确和优雅。而是经过认真的演算和推理后，知道哪些地方是必须做的，哪些地方是有风险的，哪些地方是不需要那么精确的。我们努力应该百分之百做到的方向，应该是前两者，不仅包括必须要注意的细节，还包括利用一切方法将潜在的不利因素降到最低。而对于已经确定不需要抠细节的地方，则不但不需要，还应当尽量避免让这种事情耽误我们做其他正事的时间。
说到底，这种行为不过是一种虚假的自我感动，没有能力、不愿思考更高难度、更需要智力的方面，反而在没有丝毫难度，是个人就能做的事情上，装显出一副”我对于实验很重视、很有仪式感“的虚荣感和炫耀欲。
“完美”应体现在：
清晰而合理的对照设计
百分之百按照实验设计开展实验
不漏任何一种可能的结果分析
把时间放在刀刃上，粗中有细，真正该注意的地方分毫不差，这才是真正的“优雅”和“艺术”。
对于前两者加错试剂本身的低级错误，在这几天同时连续的出现，要反思。我已经形成的较好的实验习惯有：穿白大褂、凡加试剂必戴口罩、实验记录无论巨细务必详实，后两者是这个月养成的习惯。虽然耗费时间，但正是我所说必须注意的有风险的地方。加错试剂的问题，一个小方法就可以解决，用笔尖指向实验记录本上要加的那一行试剂，加完就往下移动一行。只要养成习惯，这个不是大问题。
碎碎念：从理性的角度上，我没加Neofect是推出的唯一可能，但我实在不愿意承认，也确实记不得自己有没有加。越发体现出人脑的不靠谱啊，加一个试剂，画一个对勾，可能每次多花3 min。但就这一次失误，浪费的就是整整4天。显然，不应在这种事情上偷懒。