PCR是玄学

昨天P了个CR，图中第一个泳道和第三个泳道这两个反应，左边4K多，右边5K多，长度相近，模板长度也相近、摩尔比几乎1:1。PCR温度程序相同。但是结果左边只得到一条细细的条带，右边过曝成那个样子了。不知道是为啥。我查了一下二者用的引物GC含量，左边泳道的两条是37%和60%，右边是57%和60%，不知道是不是37%GC的引物跟模板结合不够紧。当然这也没什么对照可言，就是感叹PCR结果的亮度不可信。

想起上个月遇到需要知道一个组织中某基因不同isoform的表达量问题，还想根据isoform之间的差异区段设计不同的引物去qPCR，这样一看再精心控制多对引物之间的参数尽量一致，结果也可能完全没有可比性（除非是0或1、有或完全无的关系）。（不过也可能是我这个PCR太长了，qPCR的引物扩增片段不超过150bp，可能误差的放大就会比上图小一些）

也许还是做RNA-seq更直观，不过我还不清楚RNA-seq是否能够区分只有长短差异（而在公共部分无序列差异）的isoforms。 //应该是可以的，因为每个单个儿的reads会在基因组中体现出Junction。

另外，今天得到一个克隆的测序结果，跟CDS比对发现C端缺了一端，但是最C端还是有一小段仍然在的，对着IGV上的RNA-seq数据看了半天，应该是基因组注释中少注释了一个内含子。还引发一个值得思考的问题，基因组注释都是按物种分的，比如人的、鼠的。但是不同cell line和组织中的RNA转录和剪接方式都有差别，在某个组织中是内含子的、在另一个组织中可能就是外显子，或者UTR。一个物种的所有cell line和组织都共用一套基因组注释的话就有问题了。